circKIF4A-miR-637-STAT3的新軸促進(jìn)三陰性乳腺癌的腦轉(zhuǎn)移

         在三陰性乳腺癌(TNBC)患者中，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致死亡的主要原因。我們之前的研究表明，circKIF4A極大地促進(jìn)了TNBC的進(jìn)展，但其在TNBC腦轉(zhuǎn)移中的作用和分子機(jī)制仍然不確定。在這項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)circKIF4A在TNBC細(xì)胞系和腦轉(zhuǎn)移中顯著上調(diào)。抑制circKIF4A會(huì)損害TNBC的增殖、遷移和引起腦轉(zhuǎn)移的能力。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)circKIF4A與STAT3 3’UTR競(jìng)爭(zhēng)miR-637的結(jié)合。Western blot分析顯示，抑制circKIF4A可降低STAT3和p62的表達(dá)，同時(shí)增加LC3B-II/ LC3B-I比值和Beclin的表達(dá)，表明circKIF4A下調(diào)通過與STAT3競(jìng)爭(zhēng)miR- 637結(jié)合而誘導(dǎo)自噬。通過采用競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA (ceRNA)機(jī)制，circKIF4A-miR-637-STAT3軸協(xié)調(diào)TNBC中的腦轉(zhuǎn)移。因此，circKIF4A可以作為TNBC腦轉(zhuǎn)移的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。本文于2023年11月發(fā)表于“Cancer Letter”（IF=9.7）上。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）抑制circKIF4A可損害TNBC的增殖、遷移和侵襲

         為了探索KIF4A衍生的環(huán)狀RNA hsa_circ_0007255 (circKIF4A)在TNBC腦轉(zhuǎn)移中的功能，我們采用qRT-PCR驗(yàn)證了circKIF4A在腦轉(zhuǎn)移和原發(fā)性乳腺癌組織中的表達(dá)。22例腦轉(zhuǎn)移患者顯示circKIF4A水平升高，且在腦轉(zhuǎn)移組織中明顯升高(圖1A)。然后我們?cè)?span>TNBC細(xì)胞系和MCF10A中進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)circKIF4A在TNBC細(xì)胞系中上調(diào)(圖1B)。用RNase R(核糖核酸酶R)處理HCC1806和SUM159PT細(xì)胞株RNA樣品后，我們使用qRT-PCR檢測(cè)了兩株細(xì)胞株中circKIF4A及其親本基因編碼KIF4A mRNA和GAPDH的表達(dá)水平。結(jié)果表明，與線性KIF4A mRNA和GAPDH相比，circKIF4A對(duì)RNase R處理具有更強(qiáng)的耐受性，這與環(huán)狀RNA的特征一致(圖1C)。我們?cè)O(shè)計(jì)了兩個(gè)siRNA來(lái)探索circKIF4A的功能，并通過RT-qPCR在TNBC細(xì)胞中驗(yàn)證了其敲低作用(圖1D)。采用CCK-8和集落形成法檢測(cè)TNBC細(xì)胞的活力，結(jié)果表明，抑制circKIF4A可顯著損害TNBC細(xì)胞的增殖能力(圖1E, F, I)。此外，在傷口愈合和transwell試驗(yàn)中，敲低circKIF4A可抑制TNBC細(xì)胞的遷移和侵襲能力(圖1G-I)。這些結(jié)果表明，抑制circKIF4A會(huì)損害TNBC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

2）下調(diào)circKIF4A抑制TNBC細(xì)胞的增殖和腦轉(zhuǎn)移

         在通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了circKIF4A在TNBC細(xì)胞中的促瘤作用后，我們利用穩(wěn)定敲除circKIFA的HCC-1806細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞構(gòu)建TNBC異種移植模型，研究circKIF4A在體內(nèi)是否具有相同的作用。注射腫瘤細(xì)胞后，每周一次測(cè)量小鼠移植腫瘤的大小，繪制生長(zhǎng)曲線。4周后，對(duì)小鼠進(jìn)行體外熒光成像，安樂死后切除腫瘤。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，穩(wěn)定敲低circKIF4A組移植腫瘤的大小明顯減小(圖2A-C)。sh-circKIF4A組腫瘤重量明顯降低(圖2D)。此外，對(duì)裸鼠腫瘤進(jìn)行免疫組化，結(jié)果顯示sh-NC組細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki-67顯著升高(圖2E)。為了進(jìn)一步研究circKIF4A在TNBC腦轉(zhuǎn)移中的作用，我們通過左心室注射穩(wěn)定敲除circKIF4A并表達(dá)熒光素酶的HCC1806細(xì)胞以及對(duì)照細(xì)胞，構(gòu)建了腦轉(zhuǎn)移模型(圖2F)。培養(yǎng)50天后，再次對(duì)小鼠進(jìn)行體外熒光成像，結(jié)果顯示，敲低circKIF4A可顯著抑制HCC1806細(xì)胞體內(nèi)腦轉(zhuǎn)移能力(圖2G)。穩(wěn)定敲低circKIF4A組腦轉(zhuǎn)移灶的大小和數(shù)量明顯低于對(duì)照組。circKIF4A敲低組腦轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)為2±1個(gè)，對(duì)照組為9±3個(gè)(圖2H和圖2I)。這些結(jié)果證實(shí)敲低circKIF4A可以抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的腦轉(zhuǎn)移能力。

3）circKIF4A作為海綿與miR-637結(jié)合

         利用核細(xì)胞分離試劑盒和FISH檢測(cè)circKIF4A在細(xì)胞內(nèi)的分布和定位。circKIF4A主要分布在細(xì)胞質(zhì)中(圖3A和B)。根據(jù)Targetscan預(yù)測(cè)，circKIF4A具有miR-637結(jié)合位點(diǎn)(圖3C)。同時(shí)，對(duì)22對(duì)三陰性乳腺癌腦轉(zhuǎn)移灶和原發(fā)灶的qRT-PCR檢測(cè)顯示，miR-637在腦轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)(1.84±1.16)明顯低于原發(fā)灶的腫瘤組織(5.14±1.54)(圖3D)。RT-qPCR檢測(cè)了miR-637在TNBC細(xì)胞系中的分布，結(jié)果顯示，與MCF 10A相比，miR-637在TNBC細(xì)胞系中的含量明顯較低(圖3D)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證circKIF4A與miR-637在三陰性乳腺癌細(xì)胞中的結(jié)合，我們基于circKIF4A與miR-637的潛在結(jié)合序列構(gòu)建了野生型雙熒光素酶報(bào)告載體和結(jié)合序列突變載體(圖3F)。通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步證實(shí)了TNBC細(xì)胞中circKIF4A和miR-637之間的相互作用。與轉(zhuǎn)染circKIF4A-wt和miR-CTR的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染circKIF4A-wt和miR-637模擬物的細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低。相比之下，在轉(zhuǎn)染circKIF4A-mut的細(xì)胞中，分別轉(zhuǎn)染miR-CTR和miR-637模擬物后，熒光素酶活性沒有差異(圖3G)。這些結(jié)果表明circKIF4A在TNBC中作為海綿與miR-637結(jié)合。

4）circKIFA通過miR-637調(diào)控STAT3的表達(dá)

         通過TargetScanHuman，我們發(fā)現(xiàn)STAT3是miR-637的候選下游蛋白，在多種腫瘤中發(fā)揮促癌作用(圖4A)。在TNBC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-637模擬物后，與對(duì)照組(miR-CTR)相比，miR-637模擬物在HCC1806和SUM159PT細(xì)胞系中分別下調(diào)了54.67%±6.46和49.60%±8.50的STAT3 mRNA表達(dá)(P < 0.05)(圖4B)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證三陰性乳腺癌細(xì)胞中miR-637是否通過結(jié)合STAT3’UTR調(diào)控STAT3的翻譯，我們基于miR-637與STAT 3’UTR的潛在結(jié)合序列構(gòu)建了野生型雙熒光素酶報(bào)告載體和結(jié)合序列突變載體(圖4C)。與轉(zhuǎn)染STAT3-wt和miR-CTR的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染STAT3-wt和miR-637模擬物的細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低。相比之下，在轉(zhuǎn)染STAT3-mut的細(xì)胞中，分別轉(zhuǎn)染miR-CTR和miR-637模擬物后，熒光素酶活性沒有差異(圖4D)。這些結(jié)果表明miR-637通過結(jié)合STAT3 3’ UTR發(fā)揮其功能。為了驗(yàn)證circKIF4A是否通過circKIF4A/miR-637軸調(diào)控STAT3的表達(dá)，我們通過穩(wěn)定敲低HCC1806細(xì)胞中的circKIF4A并轉(zhuǎn)染相應(yīng)的抑制劑，建立了敲低對(duì)照組(sh-circKIF4A + inhibitor NC)和拯救組(sh-circKIF4A + miR-637 inhibitor)。將未處理的細(xì)胞作為空白對(duì)照組(sh-NC +抑制劑NC)。采用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)上述各組中STAT3的表達(dá)變化。與空白對(duì)照組相比，敲低對(duì)照組STAT3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均下調(diào)；而與敲低對(duì)照組相比，拯救組STAT3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均有所升高(圖4E和4F)。這些結(jié)果表明，circKIF4A通過結(jié)合miR-637來(lái)緩解miR-637對(duì)STAT3 mRNA的抑制作用，促進(jìn)STAT3蛋白的上調(diào)，建立了circKIF4A/miR-637/STAT3調(diào)控軸。

5）STAT3過表達(dá)通過自噬恢復(fù)TNBC中circKIF4A敲低誘導(dǎo)的抑制作用

         鑒于上述結(jié)果，我們開展拯救實(shí)驗(yàn)，探討circKIF4A/miR-637/STAT3軸對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。我們構(gòu)建了STAT3過表達(dá)載體，并利用qRT-PCR檢測(cè)了STAT3在circKIF4A穩(wěn)定敲低HCC1806和SUM159PT細(xì)胞系中的過表達(dá)效率。結(jié)果顯示，用過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后，STAT3的表達(dá)水平顯著增加(圖5A)。CCK-8和集落形成拯救實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，STAT3過表達(dá)可顯著恢復(fù)TNBC的增殖能力(圖5B, E, F)。Transwell和傷口愈合實(shí)驗(yàn)表明，STAT3過表達(dá)可以恢復(fù)TNBC細(xì)胞中被circKIF4A敲低抑制的侵襲能力(圖5C, D, F)。Western blot檢測(cè)證實(shí)STAT3和p62下調(diào)；但Beclin表達(dá)和LC3B-II/ LC3B-I通過敲低circKIF4A而上調(diào)，而與STAT3過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染顯著逆轉(zhuǎn)了這一變化(圖5D)，表明抑制circKIF4A通過與STAT3競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-637來(lái)促進(jìn)自噬。這些結(jié)果可能解釋了circKIF4A通過circKIF4A /miR-637/STAT3軸調(diào)控自噬進(jìn)而促進(jìn)TNBC腦轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

結(jié)論：

          circKIF4A-miR-637-STAT3軸通過競(jìng)爭(zhēng)性ceRNA機(jī)制調(diào)節(jié)TNBC腦轉(zhuǎn)移。因此，circKIF4A是診斷和治療TNBC腦轉(zhuǎn)移的一個(gè)有前景的生物標(biāo)志物。

實(shí)驗(yàn)方法：

         qRT-PCR，CCK-8，Transwell，傷口愈合試驗(yàn)，集落形成試驗(yàn)，熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)，Western blot，IHC，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)：

         Wu S, Lu J, Zhu H, Wu F, Mo Y, Xie L, Song C, Liu L, Xie X, Li Y, Lin H, Tang H. A novel axis of circKIF4A-miR-637-STAT3 promotes brain metastasis in triple-negative breast cancer. Cancer Lett. 2024 Jan 28;581:216508. doi: 10.1016/j.canlet.2023.216508.