NRF2通過(guò)與TOPBP1協(xié)同激活A(yù)TR-CHK1信號(hào)通路促進(jìn)輻射抵抗

肺癌是一種致命的惡性腫瘤，每天死亡人數(shù)超過(guò)350人。臨床研究表明約77%的肺癌患者接受放療（Radiotherapy，RT）。盡管放療的療效顯著改善，但癌細(xì)胞在連續(xù)暴露于電離輻射（Ionizing Radiation，IR）時(shí)產(chǎn)生抗性導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。IR主要通過(guò)引起DNA損傷，特別是雙鏈斷裂（DSBs）來(lái)殺死癌細(xì)胞。輻射抗性癌細(xì)胞已經(jīng)發(fā)展出強(qiáng)大的DNA損傷修復(fù)能力來(lái)生存IR。核因子?紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（Nuclear Factor Erythroid 2-related Factor 2，NRF2）與輻射抗性相關(guān)。在本研究中，作者采用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和組織芯片分析NRF2與肺癌患者預(yù)后的相關(guān)性，構(gòu)建耐輻射肺癌細(xì)胞，通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)探討NRF2在抗輻射中的作用，并采用免疫沉淀、免疫熒光和染色質(zhì)級(jí)分提取等方法探討其潛在機(jī)制。本研究證明NRF2通過(guò)與RPA32和TOPBP1合作激活ATR-CHK1信號(hào)通路增強(qiáng)輻射抗性，還驗(yàn)證了NRF2可作為放療的潛在靶點(diǎn)。

該研究于2024年1月1日發(fā)表在《Theranostics》，IF：12.4

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1.NRF2/KEAP1基因改變引起NRF2激活與肺癌患者預(yù)后不良相關(guān)

作者通過(guò)c-BioPortal網(wǎng)站分析了肺癌患者NRF2/KEAP1基因的變異類型。在分析了來(lái)自29項(xiàng)研究的12,478個(gè)樣本/ 9,930名肺癌患者后，發(fā)現(xiàn)NRF2和KEAP1基因的總變異分別為4%和13%（圖1A）。遺傳突變是NRF2和KEAP1基因變異的主要形式。在拷貝數(shù)變異類型中，擴(kuò)增是NRF2的主要改變類型，而KEAP1的主要改變類型是缺失（圖1A）。肺癌的不同亞型，如肺腺癌（LUAD）和肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC），具有不同的細(xì)胞變異類型，導(dǎo)致不同的生長(zhǎng)特征。此外，作者發(fā)現(xiàn)NRF2的擴(kuò)增和突變主要發(fā)生在LUSC（圖1B），KEAP1基因變異在LUAD中發(fā)生更頻繁（圖1C）。接下來(lái)通過(guò)RNA-seq分析表明，LUAD和LUSC中NRF2的主要CNV類型是擴(kuò)增和增益，這導(dǎo)致NRF2 mRNA表達(dá)增加（圖1D-E）。KEAP1的主要變異類型是淺缺失，伴隨著較低的KEAP1 mRNA表達(dá)（圖1F-G）。此外還調(diào)查了NRF2/KEAP1基因改變組和NRF2/KEAP1基因未改變組患者之間的臨床結(jié)果。結(jié)果表明，NRF2/KEAP1基因的基因改變與較短的總生存期相關(guān)（圖1H-I）。NRF2/KEAP1基因改變患者的總生存期中位數(shù)分別為38.24和38.14個(gè)月，而無(wú)基因改變組分別為56.35和54.34個(gè)月。因此，上述結(jié)果表明，NRF2/KEAP1基因變異導(dǎo)致NRF2表達(dá)水平升高，并與肺癌患者預(yù)后不良有關(guān)。

圖1：NRF2/KEAP1變異導(dǎo)致的NRF2過(guò)表達(dá)與肺癌患者預(yù)后不良相關(guān)

IHC檢測(cè)由LUAD患者和鄰近非癌組織作為對(duì)照的肺癌組織樣本組成的腫瘤微陣列（TMA）中NRF2蛋白的表達(dá)。用NRF2抗體染色TMA，并根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)估評(píng)分。根據(jù)細(xì)胞質(zhì)中NRF2染色強(qiáng)度將LUAD樣本分為高/中/低NRF2表達(dá)水平的三組（圖2A）。在LUAD組中，44%的患者屬于NRF2高表達(dá)組（圖2B），該組患者的中位壽命為31.23個(gè)月（圖2C）。接下來(lái)作者根據(jù)NRF2蛋白在細(xì)胞核中的定位將患者分為陽(yáng)性和陰性組，結(jié)果顯示核NRF2檢測(cè)陽(yáng)性的患者的壽命明顯短于檢測(cè)陰性的患者（圖2D-E）。

總體而言，TMA結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果一致，表明肺癌患者NRF2蛋白高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)。

圖2：組織芯片染色NRF2與LUAD患者預(yù)后的相關(guān)性分析。

2.放療抵抗細(xì)胞中NRF2高表達(dá)

作者建立了人類肺癌抗輻射細(xì)胞并通過(guò)集落形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)肺癌細(xì)胞和肺癌放療抵抗細(xì)胞使用質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激信號(hào)通路發(fā)生變化。檢測(cè)了輻射抵抗細(xì)胞中NRF2的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)與A549細(xì)胞相比，A549R細(xì)胞中具有抗氧化應(yīng)激功能的NRF2蛋白及其下游血紅素氧合酶-1（HO-1）顯著上調(diào)（圖3A）。NRF2向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移是激活下游基因的先決條件，這些基因編碼一系列II期解毒或抗氧化酶。核質(zhì)分離結(jié)果顯示，與H460和H1299細(xì)胞相比，H460R和H1299R細(xì)胞核中NRF2蛋白水平顯著升高（圖3B-C）。此外，免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，在H1299R細(xì)胞中NRF2熒光信號(hào)更強(qiáng)烈（圖3E）。這些結(jié)果表明NRF2在輻射抗性細(xì)胞中上調(diào)，并優(yōu)先積累在細(xì)胞核中。

有研究報(bào)道過(guò)NRF2可通過(guò)激活ATR/CHK1通路導(dǎo)致DSBs和G2/M細(xì)胞周期停滯。因此作者接下來(lái)監(jiān)測(cè)了放射抗性細(xì)胞中ATR信號(hào)級(jí)聯(lián)的變化。WB結(jié)果顯示，IR誘導(dǎo)H460和H1299細(xì)胞中ATR和CHK1的磷酸化，H460R和H1299R細(xì)胞中ATR和CHK1的磷酸化水平明顯更高（圖3F-G）。采用免疫熒光監(jiān)測(cè)γ-H2AX以評(píng)估DNA損傷。紅外線照射后，A549R細(xì)胞γ-H2AX病灶的數(shù)量顯著低于A549細(xì)胞，表明輻射抵抗細(xì)胞的DNA修復(fù)能力優(yōu)于對(duì)照細(xì)胞（圖3H）。H460和H1299細(xì)胞也觀察到類似的趨勢(shì)（圖3I-J）。上述結(jié)果表明，輻射抵抗細(xì)胞中高水平的NRF2蛋白增強(qiáng)了DNA損傷修復(fù)能力，這可能是肺癌細(xì)胞可以發(fā)生輻射抵抗的原因之一。.

圖3：NRF2在抗輻射細(xì)胞中表達(dá)顯著

3. 體內(nèi)NRF2過(guò)表達(dá)的抗輻射細(xì)胞對(duì)放療的抗性更強(qiáng)

將穩(wěn)定表達(dá)GFP的A549和A549R細(xì)胞注射到裸鼠尾靜脈，6周后成功構(gòu)建肺腫瘤轉(zhuǎn)移模型，將小鼠分為對(duì)照組（A549）、抗輻射細(xì)胞組（A549R）、對(duì)照照射組（A549-IR）、抗輻射細(xì)胞照射組（A549R-IR）四組。每周用2或4 Gy分次劑量的γ射線局部照射肺部，治療持續(xù)3周（圖4A）。熒光信號(hào)檢測(cè)到肺部腫瘤轉(zhuǎn)移（圖4B）。與A549組相比，A549-IR組放療后肺腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)量明顯減少。相比之下，在注射A549R細(xì)胞的小鼠中，接受或不接受放療的肺轉(zhuǎn)移數(shù)量沒(méi)有觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異，提示A549R腫瘤對(duì)IR更具抗性（圖4C-D）。結(jié)果顯示A549R細(xì)胞在體內(nèi)也具有抗輻射性。肺組織切片IHC分析顯示，A549細(xì)胞源性腫瘤中的Ki67陽(yáng)性染色在照射后顯著下降，但A549R-IR組與A549R-未照射組的Ki67豐度差異較小，提示IR可能不能有效抑制A549R細(xì)胞的增殖（圖4E）。此外，用IHC檢測(cè)NRF2的染色強(qiáng)度。A549組的NRF2染色在照射后顯著下降，而A549R組的變化不顯著（圖4F）?？偟膩?lái)說(shuō)，這些研究結(jié)果表明NRF2蛋白與體內(nèi)肺癌細(xì)胞的輻射抵抗之間存在關(guān)聯(lián)。

接下來(lái)，作者通過(guò)Nrf2+/ -C57BL/6小鼠雜交得到Nrf2+/+和Nrf2-/-幼鼠，以進(jìn)一步探索NRF2在體內(nèi)響應(yīng)IR中的作用（圖4G）。將Nrf2+/+和Nrf2-/-小鼠暴露于兩種劑量的IR（7.2和6.5 Gy）（圖4H），發(fā)現(xiàn)Nrf2-/-小鼠表現(xiàn)出更高更快的死亡率（圖4I和4K）。Nrf2-/-小鼠的平均體重在全身照射（TBI）后繼續(xù)下降；而，Nrf2+/+小鼠的平均體重在TBI后大約20天趨于穩(wěn)定（圖4J和4L）。這些結(jié)果表明，缺失NRF2基因?qū)е螺椛浔┞逗笮∈笏劳雎瘦^高，這意味著NRF2可能在體內(nèi)對(duì)輻射反應(yīng)中發(fā)揮保護(hù)作用。

圖4：NRF2過(guò)表達(dá)的放射抗性細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)放療的抗性更強(qiáng)

4. NRF2激活ATR/CHK1通路獨(dú)立于其轉(zhuǎn)錄功能

接下來(lái)，作者試圖闡明NRF2導(dǎo)致放射抗藥性的機(jī)制。在A549和H1299細(xì)胞中，照射以劑量依賴性的方式增加NRF2蛋白水平（圖5A-B）；8 Gy照射以時(shí)間依賴性的方式增加NRF2蛋白水平（圖5C-D）。之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NRF2蛋白在肺癌組織細(xì)胞核中的積累與肺癌預(yù)后較差有關(guān)（圖2D-E），抗輻射細(xì)胞細(xì)胞核中的NRF2蛋白水平也較高（圖3B-C）。因此，從細(xì)胞中分離出染色質(zhì)，并檢查照射后NRF2與染色質(zhì)的結(jié)合。結(jié)果表明，照射后NRF2蛋白與染色質(zhì)的結(jié)合顯著增加（圖5E），這表明NRF2在紅外下轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并與染色質(zhì)結(jié)合。此外，通過(guò)免疫熒光研究NRF2的亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明，NRF2被招募到激光微照射引起的DNA損傷位點(diǎn)，并在H1703和A549細(xì)胞中與γ-H2AX共定位（圖5F）。

NRF2作為一種轉(zhuǎn)錄因子在應(yīng)激條件下調(diào)節(jié)BRCA1和53BP1的表達(dá)。BRCA1和53BP1都是DNA損傷反應(yīng)過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白。在A549細(xì)胞中敲低NRF2后53BP1和BRCA1蛋白的水平顯著下降；而53BP1和BRCA1的敲低并不影響CPT處理后ATR和CHK1的激活（圖5G）。這些結(jié)果表明53BP1和BRCA1可能不是NRF2/ATR/CHK1信號(hào)通路激活的介導(dǎo)者。為了確認(rèn)NRF2促進(jìn)ATR-CHK1信號(hào)通路的激活不依賴于其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，作者構(gòu)建了刪除Neh1結(jié)構(gòu)域的NRF2突變質(zhì)粒（Δ434-561-NRF2）（圖5H），并在A549-NRF2 KO細(xì)胞中分別表達(dá)HA-NRF2和Δ434-561-NRF2。當(dāng)細(xì)胞用8 Gy IR處理時(shí)，HA-NRF2和Δ434-561-NRF2的表達(dá)都顯著促進(jìn)ATR和CHK1磷酸化（圖5I）。這些結(jié)果表明NRF2可以保持獨(dú)立于轉(zhuǎn)錄功能的基因組穩(wěn)定性。

圖5：NRF2激活ATR/CHK1通路獨(dú)立于其轉(zhuǎn)錄功能

5. NRF2促進(jìn)RPA32磷酸化和RPA在ssDNA的積累

NRF2可以直接結(jié)合并激活ATR，而RPA調(diào)節(jié)ATR激活。因此，作者探討了NRF2是否可以影響RPA在DNA損傷過(guò)程中的作用。RPA70和RPA32是RPA復(fù)合物的兩個(gè)主要亞基。在照射后6、12和24小時(shí)檢查了用siNRF2處理或未處理的A549細(xì)胞中RPA32和RPA70病灶的數(shù)量。免疫熒光結(jié)果顯示，敲低NRF2后A549細(xì)胞中RPA70病灶陽(yáng)性細(xì)胞的比例明顯高于A549細(xì)胞暴露于IR后（圖6A）。同樣，敲低NRF2降低了細(xì)胞暴露于IR后RPA32病灶陽(yáng)性細(xì)胞的比例（圖6B-C）。DNA結(jié)合的RPA與許多蛋白質(zhì)相互作用以調(diào)節(jié)DNA代謝，RPA封裝的ssDNA也是復(fù)制應(yīng)激誘導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)過(guò)程的平臺(tái)。接下來(lái)，提取染色質(zhì)結(jié)合蛋白以確定NRF2是否影響RPA32蛋白與DNA的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)NRF2的敲除在照射后顯著抑制RPA32蛋白與染色質(zhì)的結(jié)合，但不影響RPA32的可溶性形式（圖6D）。結(jié)果暗示NRF2可能有助于RPA32與染色質(zhì)的結(jié)合在DNA損傷條件下形成病灶。

進(jìn)一步研究了NRF2是否會(huì)影響RPA32的磷酸化。在A549細(xì)胞中，NRF2的敲低降低了CPT處理后RPA在Ser33和Thr21的磷酸化（圖6E）。此外還觀察到RPA32（Ser33、Thr21和S4/S8）的磷酸化水平在照射后10小時(shí)內(nèi)持續(xù)增加，且A549R細(xì)胞中RPA32的磷酸化增加更加明顯（圖6F）。NRF2敲除細(xì)胞中RPA32的磷酸化明顯低于野生型細(xì)胞，并且通過(guò)在CPT（圖6G）處理后將Flag-NRF2重新引入A549-NRF2KO細(xì)胞來(lái)挽救這一缺陷。因此，研究結(jié)果表明NRF2通過(guò)促進(jìn)DNA損傷過(guò)程中RPA32的磷酸化來(lái)影響DNA上RPA的招募。

圖6：NRF2促進(jìn)RPA32的磷酸化和RPA在ssDNA的積累。

6. NRF2協(xié)同TOPBP1激活ATR/CHK1信號(hào)通路

RPA32和CHK1都是ATR的磷酸化底物。有研究表明，TOPBP1和ETAA1的激活對(duì)應(yīng)于不同的ATR功能。ETAA1在正常和應(yīng)激復(fù)制過(guò)程中負(fù)責(zé)ATR介導(dǎo)的RPA磷酸化，而TOPBP1激活ATR/CHK1信號(hào)通路以響應(yīng)復(fù)制應(yīng)激。NRF2、TOPBP1和ETAA1在A549細(xì)胞中分別敲除，以比較NRF2、TOPBP1和ETAA1之間的差異。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染siNRF2的A549細(xì)胞在8Gy照射后ATR和CHK1的磷酸化水平比轉(zhuǎn)染siTOPBP1和siETAA1的細(xì)胞更顯著降低，表明NRF2在ATR的磷酸化中發(fā)揮了重要作用（圖7A）。而與單獨(dú)敲除NRF2相比，同時(shí)敲除TOPBP1和NRF2并沒(méi)有進(jìn)一步降低ATR磷酸化水平（圖7A）。這些觀察結(jié)果表明NRF2可能與TOPBP1在同一途徑中發(fā)揮作用。因此，構(gòu)建的Flag-TOPBP1和HA-NRF2融合蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，用60 nM CPT處理細(xì)胞后，siTOPBP1在H1299R細(xì)胞中ATR/CHK1沒(méi)有磷酸化（圖7B）。表達(dá)HA-NRF2沒(méi)有挽救這一缺陷，這表明TOPBP1在NRF2/ATR/CHK1途徑中的關(guān)鍵作用（圖7B）。同時(shí)，Flag-TOPBP1的表達(dá)也未能磷酸化ATR和CHK1。

TOPBP1通過(guò)與RAD9-HUS1-RAD1（9-1-1）的復(fù)合物被招募到DNA損傷位點(diǎn)，并通過(guò)其AAD樣區(qū)域結(jié)合介導(dǎo)ATR的磷酸化。在染色質(zhì)結(jié)合蛋白檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，WB顯示NRF2的下調(diào)顯著抑制了TOPBP1蛋白與輻照A549細(xì)胞染色質(zhì)的結(jié)合（圖7D）。使用靶向HPRT基因的Cas9/sgRNA實(shí)現(xiàn)了位置特異性DNA雙鏈斷裂，以進(jìn)一步證實(shí)NRF2在TOPBP1招募到DNA損傷位點(diǎn)中的作用。熒光顯微鏡顯示TOPBP1與A549細(xì)胞中的γH2AX共定位。NRF2缺乏顯著減弱了A549-NRF2KO細(xì)胞中TOPBP1病灶的強(qiáng)度（圖7E-F）。圖7G結(jié)果清楚地表明，A549細(xì)胞中激光微輻射后TOPBP1被招募到DNA損傷位點(diǎn)，但在A549-NRF2KO細(xì)胞中沒(méi)有。這些結(jié)果表明，NRF2可以影響DNA損傷期間TOPBP1招募。接下來(lái)使用Co-IP驗(yàn)證DNA損傷中TOPBP1和NRF2之間的相互作用。從A549細(xì)胞的染色質(zhì)和可溶性提取物中免疫沉淀NRF2后可檢測(cè)到TOPBP1。此外，在IR后細(xì)胞的染色體提取物中TOPBP1和NRF2之間的相互作用增強(qiáng)（圖7H）。這些結(jié)果表明NRF2與TOPBP1合作促進(jìn)ATR/CHK1信號(hào)通路的激活，并對(duì)照射后TOPBP1向DNA損傷位點(diǎn)的募集有促進(jìn)作用。

圖7：NRF2協(xié)同TOPBP1激活ATR/CHK1信號(hào)通路

結(jié)論

作者證明NRF2的高核表達(dá)與肺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，并有助于輻射抗性的發(fā)展。響應(yīng)IR或CPT，NRF2被轉(zhuǎn)移到DNA損傷位點(diǎn)，促進(jìn)RPA32的磷酸化，并通過(guò)招募TOPBP1到DNA損傷位點(diǎn)激活ATR/CHK1通路（圖8）。這項(xiàng)研究表明NRF2可能是改善肺癌放療的一個(gè)有希望的靶點(diǎn)。

圖8

實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)胞培養(yǎng)和藥物治療，組織微陣列，輻射抗性細(xì)胞系構(gòu)建，全細(xì)胞裂解物收集和蛋白質(zhì)印跡法，免疫熒光分析，Co-IP實(shí)驗(yàn)，活性氧水平的測(cè)定，集落形成試驗(yàn)，腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)，核和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)提取，提取染色質(zhì)部分，慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，小鼠實(shí)驗(yàn)，免疫組織化學(xué)染色，TUNEL實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)

Sun Xiaohui, Dong Mingxin, Li Jiale, et al. NRF2 promotes radiation resistance by cooperating with TOPBP1 to activate the ATR-CHK1 signaling pathway. [J]. Theranostics, 2024, 14: 681-698.