組蛋白乳酸化增強(qiáng)的ALKBH3通過m1A去甲基化促進(jìn)腫瘤進(jìn)展

         雖然N1 -甲基腺苷（m1A）RNA修飾是RNA代謝的重要調(diào)節(jié)因子，但m1A修飾在腫瘤發(fā)生中的作用仍不清楚。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)組蛋白乳酸化通過去除SP100A的m1A甲基化，增強(qiáng)ALKBH3的表達(dá)，同時(shí)減少腫瘤抑制性早幼粒細(xì)胞白血病蛋白（PML）凝集物的形成，促進(jìn)癌癥的惡性轉(zhuǎn)化。在機(jī)制上，YTHDF1負(fù)責(zé)識別m1A甲基化SP100A轉(zhuǎn)錄物，從而提高其RNA穩(wěn)定性和翻譯效率。該研究于2023年12月發(fā)表在《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》，IF：14.9。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. ALKBH3 在眼部黑色素瘤中的特異性增高與不良預(yù)后有關(guān)

         為了確定m1A修飾在眼部黑色素瘤發(fā)病機(jī)制中的作用，首先比較了眼部黑色素瘤樣本（3個(gè)CoM樣本和3個(gè)UM樣本）和4個(gè)對照痣樣本的總體m1A修飾水平。值得注意的是，眼黑色素瘤樣本的m1A水平明顯降低，這一點(diǎn)已通過抗m1A點(diǎn)印跡檢測得到證實(shí)（圖1A和B）。此外，去甲基化酶ALKBH3在腫瘤中的蛋白表達(dá)也增加了（圖1C-E），這與眼黑色素瘤中m1A水平降低的發(fā)現(xiàn)一致。此外，ALKBH3的升高與不良預(yù)后有關(guān)（圖1F），這進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了ALKBH3在眼部黑色素瘤癌變過程中的重要性。一致的是，與正常色素細(xì)胞（PIG1）相比，大多數(shù)黑色素瘤細(xì)胞系（MUM2B、OCM1、OMM2.3、OMM1、MEL290、92.1、CRMM1、CRMM2、CM2005.1）的m1A水平顯著下降（圖1G和H），ALKBH3水平顯著升高（圖1I-K）。此外，高通量轉(zhuǎn)錄組測序進(jìn)一步證實(shí)了ALKBH3在眼黑色素瘤細(xì)胞系中的上調(diào)（圖1L）。重要的是，在這些細(xì)胞中，ALKBH3與m1A水平呈顯著負(fù)相關(guān)，表明上調(diào)的ALKBH3是m1A水平降低的原因（圖1M）。

圖1. 眼部黑色素瘤的ALKBH3表達(dá)增加，m1A水平降低，與存活率低有關(guān)

2. ALKBH3 在體外和體內(nèi)加速眼部黑色素瘤的致癌過程

         為了探索 ALKBH3 的致癌功能，使用兩種 shRNAs 沉默ALKBH3 的表達(dá)（圖 2A 和 B）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALKBH3 缺失的細(xì)胞中 m1A 水平明顯升高（圖 2C）。此外，在所有測試的眼黑色素瘤細(xì)胞中，ALKBH3沉默導(dǎo)致細(xì)胞生長（圖2D）和集落形成能力（圖2E和F）顯著減弱。此外，如 Transwell 試驗(yàn)所示，敲除 ALKBH3 會導(dǎo)致遷移能力下降（圖 2G 和 H）。這些數(shù)據(jù)證明了ALKBH3是眼黑色素瘤體外惡性增殖和轉(zhuǎn)移的必要致癌因子。為了評估它們在體內(nèi)形成腫瘤的能力，將對照組和ALKBH3沉默的92.1黑色素瘤細(xì)胞（熒光素酶標(biāo)記）注射到裸鼠體內(nèi)，并在正位異種移植模型中監(jiān)測腫瘤的生長。生物發(fā)光成像顯示，ALKBH3缺陷眼黑色素瘤細(xì)胞的信號強(qiáng)度比對照細(xì)胞弱（圖2I）。此外，ALKBH3沉默組的異種移植物平均重量減少了80%（圖2J）?？傊?，這些實(shí)驗(yàn)證明了ALKBH3在體外和體內(nèi)眼黑色素瘤的腫瘤發(fā)生過程中起著致癌作用。

圖2. 敲除 ALKBH3 可提高 m1A 水平并抑制眼部黑色素瘤的發(fā)生

3. 組蛋白乳酸化可促進(jìn) ALKBH3 的過度表達(dá)

         為了確定ALKBH3表達(dá)增加的分子基礎(chǔ)，查詢TCGA數(shù)據(jù)庫，篩選與ALKBH3表達(dá)模式相似的基因。乳酸生成酶LDHA和LDHB與ALKBH3呈顯著正相關(guān)，表明ALKBH3與乳酸之間存在關(guān)聯(lián)（圖3A和B）。然后，驗(yàn)證了眼部黑色素瘤隊(duì)列中泛乳化和組蛋白乳酸化標(biāo)記（H3K18la）之間的表達(dá)模式，結(jié)果顯示它們與ALKBH3蛋白的表達(dá)呈顯著的正相關(guān)（圖3B和C）。更重要的是，H3K18la的CUT&Tag和ChIP-seq分析都表明，在ALKBH3的啟動子區(qū)域捕獲到了強(qiáng)大的組蛋白乳酸化信號（存于GEO數(shù)據(jù)庫：GSE242019，圖3D和E）。此外，組蛋白乳酸化抑制劑（草銨膦酸鹽和 2-DG）和 LDHA/B 抑制劑都會導(dǎo)致 ALKBH3 啟動子區(qū)域的組蛋白乳酸化水平急劇下降（圖 3F），進(jìn)而在所有測試的黑色素瘤細(xì)胞中消減 ALKBH3 的 RNA（圖 3G）和蛋白水平（圖 3H-J）。

圖3. 組蛋白乳化可促進(jìn) ALKBH3 的表達(dá)

4. 多組學(xué)篩選確定 SP100A 為 ALKBH3 的下游候選者

         由于ALKBH3負(fù)責(zé)去除RNA中的m1A修飾，首先對眼部黑色素瘤細(xì)胞和正常黑色素細(xì)胞進(jìn)行m1A-MeRIP-seq分析（存于GEO數(shù)據(jù)庫：GSE213748，圖4A）。結(jié)果，從正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的m1A-MeRIP-seq文庫中分別鑒定出了平均16 864個(gè)和10 212個(gè)m1A峰（圖4A和B，藍(lán)框）。此外，在沉默 ALKBH3 后，對 92.1 黑色素瘤細(xì)胞系進(jìn)行了一系列全面的高通量篩選，包括 m1A-MeRIP-seq（存入 GEO 數(shù)據(jù)庫：GSE213748，圖 4C，棕色框）、RNA-seq（存入 GEO 數(shù)據(jù)庫：GSE213681，圖 4D 和 E，綠色框）和蛋白質(zhì)組分析（iTRAQ，圖 4F）： 對 92.1 黑色素瘤細(xì)胞系進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析（iTRAQ，圖 4F）。同樣，m1A修飾位點(diǎn)的變化明顯富集于腫瘤相關(guān)通路，包括PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、病灶粘附和蛋白多糖合成（圖4C）。此外，沉默 ALKBH3 導(dǎo)致基因表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化，上調(diào)基因達(dá) 199 個(gè)，下調(diào)基因達(dá) 74 個(gè)（圖 4D 和 E，存于 GEO 數(shù)據(jù)庫：GSE213681）。同樣，蛋白質(zhì)組水平也發(fā)生了巨大的全基因組變化（149個(gè)蛋白上調(diào)，67個(gè)蛋白下調(diào)，圖4F），進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了ALKBH3在眼部黑色素瘤發(fā)病機(jī)制中的重要性。

         有趣的是，結(jié)合這些多組學(xué)數(shù)據(jù)注意到，在眼黑色素瘤細(xì)胞中沉默ALKBH3后，核自身抗原斑點(diǎn)蛋白100（SP100）在mRNA和蛋白質(zhì)水平上都上調(diào)了，而m1A修飾水平也發(fā)生了巨大變化（圖4G-M）。值得注意的是，SP100 負(fù)責(zé) PML 核體的形成，主要作為各種癌癥類型的腫瘤發(fā)生抑制因子，包括黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、細(xì)肌肉瘤、乳腺癌和喉癌。這一觀察結(jié)果與在 ALKBH3 基因缺陷細(xì)胞中觀察到的抑制效果相吻合。m1A-MeRIP-seq（存入 GEO 數(shù)據(jù)庫：GSE213748，圖 4I）和 m1A-MeRIP-qPCR （圖 4J）都表明，眼部黑色素瘤細(xì)胞中的 m1A 修飾水平在 ALKBH3 抑制后得到恢復(fù)。通過 RNA-seq（存于 GEO 數(shù)據(jù)庫：GSE213681，圖 4K）和 qPCR（圖 4L）驗(yàn)證了抑制 ALKBH3 后 SP100 在 mRNA 水平上顯著上調(diào)。Western 印跡檢測（圖 4M）顯示，SP100 在 ALKBH3 抑制細(xì)胞中的蛋白水平也有所增加?？傊@些數(shù)據(jù)表明，ALKBH3可能會通過去除其m1A修飾來抑制SP100的表達(dá)水平。

圖4. ALKBH3 通過去除 SP100 的 m1A 修飾抑制其表達(dá)

5. SP100A 是眼部黑色素瘤的腫瘤抑制因子

         從眼部黑色素瘤細(xì)胞（92.1）和正常黑色素細(xì)胞（PIG1）獲得的 RNA-seq 數(shù)據(jù)顯示，SP100A 中的信號很突出，而 SP100A 未包含的外顯子中的信號則可以忽略不計(jì)（圖 5A）。此外，使用各種引物進(jìn)行了 qPCR。這些引物包括一組專為 SP100A 設(shè)計(jì)的引物（稱為 SP100-P1）和另一組檢測 SP100B、SP100C 和 SP100HMG 的引物（稱為 SP100-P2）。在眼部黑色素瘤細(xì)胞和正常色素細(xì)胞中觀察到了 SP100A 的 RNA 表達(dá)（圖 5B）。這些結(jié)果表明，SP100A 在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中大量表達(dá)，而其他同工酶（SP100B、SP100C 和 SP100HMG）的表達(dá)則微乎其微。值得注意的是，通過RNA-seq（圖5A）、qPCR（圖5B）和Western印跡檢測（圖5C）發(fā)現(xiàn)，與正常色素細(xì)胞相比，眼黑色素瘤細(xì)胞中SP100A的RNA表達(dá)水平也明顯下降。為了全面揭示 SP100A 在眼部黑色素瘤中的功能，測定了 SP100A 在眼部黑色素瘤臨床樣本中的表達(dá)。值得注意的是，SP100A在眼部黑色素瘤樣本中的表達(dá)量明顯下降（圖5D和E）。更重要的是，在作者隊(duì)列（圖5F）和TCGA隊(duì)列（圖5G）中，SP100A的缺失與不利的預(yù)后有關(guān)。

         過表達(dá) SP100A 后，所有受測的眼黑色素瘤細(xì)胞的增殖能力都減弱了（圖 5H）。此外，與對照組相比，過表達(dá) SP100A 的黑色素瘤細(xì)胞形成的菌落更小更少（圖 5I 和 J）。此外，在眼部黑色素瘤細(xì)胞中引入 SP100A 后，還觀察到癌癥轉(zhuǎn)移能力受到明顯抑制（圖 5K 和 L）。隨后評估SP100A過表達(dá)細(xì)胞中PML的表達(dá)情況。結(jié)果，外源過表達(dá) SP100A 導(dǎo)致 PML 蛋白水平顯著升高（圖 5M）?？傊?，這些功能增益數(shù)據(jù)揭示了SP100A負(fù)責(zé)PML核凝聚體的形成，是眼癌的腫瘤抑制因子。

圖5. SP100A 在眼部黑色素瘤中發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用

6.沉默SP100A會部分削弱ALKBH3缺陷細(xì)胞的腫瘤抑制效果

         轉(zhuǎn)染 SP100A-shRNA 到三個(gè)眼黑色素瘤細(xì)胞，在細(xì)胞生長過程中，SP100A的缺失部分（50%～60%）挽救了ALKBH3抑制作用（圖6A，紅線），SP100A缺失的細(xì)胞對ALKBH3缺失的抵抗力更強(qiáng)（圖6A）。同樣，SP100A沉默的細(xì)胞比對照組出現(xiàn)更多的菌落（圖6B，紅色和橙色柱）。此外，抑制SP100A可顯著增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力，并影響ALKBH3缺陷黑色素瘤細(xì)胞的抑制效果（圖6C）。最重要的是，SP100A的敲除進(jìn)一步挽救了ALKBH3缺失黑色素瘤細(xì)胞的正位腫瘤形成（圖6D和E）。同樣，在野生型（圖 6F，泳道 1 和 3）和 ALKBH3 缺失型眼黑色素瘤細(xì)胞（圖 6F，泳道 2 和 4）中，穩(wěn)定敲除 SP100A 會導(dǎo)致 PML 表達(dá)受損。這些結(jié)果表明，ALKBH3 通過減少 SP100A 介導(dǎo)的體內(nèi)和體外 PML 體來促進(jìn)眼黑色素瘤。。

圖6. SP100A沉默可部分阻斷ALKBH3敲除的抗癌作用

7. SP100A 的 m1A 修飾可增強(qiáng)其 RNA 穩(wěn)定性和翻譯功效

         檢測SP100A mRNA 與 YTHDF1、YTHDF2 和 YTHDF3 的 RNA 結(jié)合情況。RNA免疫沉淀分析表明，YTHDF1能特異性地識別SP100A mRNA；然而，YTHDF2和YTHDF3僅表現(xiàn)出有限的相互作用強(qiáng)度（圖7A）。此外，在TCGA隊(duì)列中，YTHDF1與SP100A的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（R = 0.61，P< 0.0001）（圖7B），這與YTHDF1是識別SP100A的必要條件這一假設(shè)完全吻合。此外，YTHDF1沉默可顯著抑制SP100A的表達(dá)，并完全挽救ALKBH3沉默介導(dǎo)的SP100A水平升高（圖7C和D）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明 YTHDF1 起著 SP100A 閱讀蛋白的作用。

         然后，確定SP100A mRNA 的特定 m1A 修飾位點(diǎn)。在 SP100A 的 5′ UTR 中，根據(jù)確定的峰值找到了五個(gè)潛在的 m1A 位點(diǎn)（圖 4I，）[c.44A（TGTGG）、c.54A（AGACG）和 c.67A （TGAGG），以及 c.92A/c.93A （GGAAG）]，并將每個(gè) A 突變?yōu)橐粋€(gè) A。 A (TGAGG)，以及 c. 92A/c. 93A (GGAAG)]，并將每個(gè) A 突變?yōu)?span> T。然后我們將相應(yīng)的野生型和突變的 5′ UTR 克隆到 pmirGLO 載體中（圖 7E，上面板）。熒光素酶報(bào)告基因檢測表明，c.A92T 的信號減弱，而其他突變組的信號保持不變（圖 7E）。此外，ALKBH3 缺失的細(xì)胞中 SP100A 的 RNA 穩(wěn)定性增強(qiáng)，這與 ALKBH3 缺失后 SP100A RNA 表達(dá)增加的結(jié)果一致（圖 7F）。重要的是，92.1 細(xì)胞中的多聚體分析表明，穩(wěn)定敲除 ALKBH3 會導(dǎo)致多聚體部分的 SP100A mRNA 豐度明顯提高（圖 7G），而多聚體部分通常具有有效的翻譯能力?？傊?，這些結(jié)果表明，SP100A mRNA 的 m1A RNA 甲基化有助于提高轉(zhuǎn)錄后的 RNA 穩(wěn)定性和翻譯能力。

圖7. SP100A 的 m1A 修飾增加了其 RNA 的穩(wěn)定性和翻譯效率

結(jié)論

         綜上所述，本研究初步證明了m1A的修飾對于腫瘤抑制基因的表達(dá)是必要的，擴(kuò)展了目前對m1A在腫瘤進(jìn)展過程中動態(tài)功能的理解。此外，這些結(jié)果表明，乳酸驅(qū)動的ALKBH3對PML核凝聚物的形成是必不可少的，這彌補(bǔ)了我們對m1A修飾，代謝重編程和相分離事件的知識。

實(shí)驗(yàn)方法：

         細(xì)胞培養(yǎng)，點(diǎn)印記，免疫熒光，WB，RNA提取和qRT-PCR，質(zhì)粒構(gòu)建，慢病毒的包裝和穩(wěn)定細(xì)胞系的產(chǎn)生，細(xì)胞增殖，克隆形成，Transwell，異種移植物模型，ChIP-seq，CUT&Tag，MeRIP-seq，RNA-seq，iTRAQ蛋白組學(xué)分析，RIP-qPCR，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，多肽體譜

參考文獻(xiàn)

         Gu X, Zhuang A, Yu J, Yang L, Ge S, Ruan J, Jia R, Fan X, Chai P. Histone lactylation-boosted ALKBH3 potentiates tumor progression and diminished promyelocytic leukemia protein nuclear condensates by m1A demethylation of SP100A. Nucleic Acids Res. 2023 Dec 20: gkad1193. doi: 10.1093/nar/gkad1193. Epub ahead of print. PMID: 38118002.