骨細胞線粒體通過STING依賴的抗腫瘤免疫抑制腫瘤發(fā)展

         骨骼是多種癌癥的常見轉移部位，包括肺癌、乳腺癌和前列腺癌。癌癥一旦轉移到骨骼，幾乎無法治愈，往往會導致骨骼疾病，包括骨痛、病理性骨折、神經壓迫綜合征，最終患者死亡。骨骼是一個高度動態(tài)的器官，它承載著多種細胞群，包括成骨細胞、破骨細胞和骨細胞。其中，骨細胞是骨中含量最豐富的細胞(>95%)，是骨代謝和穩(wěn)態(tài)的主要調節(jié)者。然而，骨細胞對轉移性癌細胞的影響仍相對不清楚和有爭議。腫瘤產生的物理力導致骨細胞的生長促進前列腺癌骨轉移。骨細胞連接蛋白43半通道活性抑制乳腺癌生長和骨轉移。最近的一項研究表明，骨細胞及其條件培養(yǎng)基(CM)可以通過Lrp5和β-catenin激活Wnt信號通路來抑制腫瘤進展和骨丟失。骨細胞有一個廣泛的樹突網絡，使其自身之間以及與骨微環(huán)境中的其他效應細胞之間能夠直接溝通。作者之前的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體通過其樹突網絡在骨細胞之間轉移，以維持骨微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。除了作為細胞“動力源”的主要作用外，線粒體最近被視為生物能、生物合成和信號傳導的細胞器。越來越多的證據(jù)表明，線粒體不僅在細胞內，而且在細胞間的信息轉導中起核心作用。細胞間線粒體轉移是一種普遍的生物事件，在生理和病理條件下均可發(fā)生。多項研究報道，線粒體在腫瘤細胞與其他細胞之間轉移，調節(jié)腫瘤發(fā)生、治療抵抗、免疫侵襲等。作者提出骨細胞通過其樹突狀網絡通過細胞間線粒體轉移與骨微環(huán)境中的轉移性癌細胞進行交流。該研究發(fā)表在《Science Advances》，IF：13.6。

技術路線：

主要研究結果：

1. 骨細胞在骨轉移過程中發(fā)揮保護作用

         為了闡明骨細胞在體內轉移性癌癥進展中的作用，作者建立了一種轉基因小鼠模型，在該模型中，出生后可以通過基于白喉毒素（DT）的細胞消融特異性靶向骨細胞。將DMP1-Cre小鼠與ROSA26-LoxP-DTR（白喉毒素受體）小鼠交配，獲得DMP1-Cre iDTR小鼠。牙本質基質蛋白1（DMP1）在骨細胞和成牙本質細胞中高表達，但在成骨細胞中不表達。給DMP1-Cre iDTR小鼠注射DT會導致骨細胞死亡，對骨小梁骨量沒有短期影響。為了評估骨細胞在轉移性腫瘤生長中的作用，作者將LLC癌細胞注射到DMP1-Cre iDTR突變小鼠及其同窩對照iDTR小鼠（圖1A）。在腫瘤植入前，小鼠注射DT以清除骨細胞。在第14天，與對照組相比，骨細胞清除小鼠的轉移性腫瘤進展增加（腫瘤體積、重量）。Micro-CT（計算機斷層掃描）分析顯示，與對照組小鼠相比，Dmp1-Cre iDTR小鼠的骨小梁體積、骨小梁數(shù)量降低，骨小梁分離增加（圖1D，E）。這些數(shù)據(jù)表明骨細胞在骨轉移微環(huán)境中發(fā)揮保護作用。

         接下來，為了探究骨轉移微環(huán)境的細胞組成，作者使用了CAG-ZsGreen小鼠模型()。在相同的骨轉移腫瘤模型中，LLC癌細胞被注射到CAG-ZsGreen小鼠腹腔內。腫瘤細胞種植后14 d處死小鼠，切除腫瘤并消化。然后，作者通過熒光激活細胞分選從CAG-ZsGreen小鼠的脛骨腫瘤中分離出浸潤細胞，并使用液滴介導的單細胞RNA測序平臺來分析FACS純化的活腫瘤浸潤細胞。然后作者使用Seurat（STAR方法）進行細胞分類和標記基因鑒定（圖1F）。作者根據(jù)已知的細胞標志物（單核細胞/巨噬細胞、破骨細胞、中性粒細胞、T/自然殺傷細胞、成纖維細胞、內皮細胞、成骨細胞和成肌細胞），使用T分布隨機鄰近嵌入（T-SNE）方法識別并可視化了8個主要集群（圖1G）。特別是在轉移微環(huán)境中幾乎沒有出現(xiàn)骨細胞（圖1H）。為了進一步研究骨轉移微環(huán)境中骨細胞和癌細胞之間的相互作用，作者建立了DMP1-Cre mGmT報告小鼠。使用流式細胞術，作者觀察到類似的結果，ZsGreen+浸潤細胞占小鼠骨轉移癌的16.10±4.55%，而tdTomato+骨細胞未出現(xiàn)在腫瘤中（圖1I）。上述結果表明，骨轉移微環(huán)境中骨細胞不能浸潤到腫瘤球體中。

圖1 骨細胞在骨轉移過程中發(fā)揮保護作用

2. 骨轉移時骨細胞將線粒體轉移到癌細胞

         接下來，作者試圖探索骨細胞如何在骨轉移微環(huán)境中調控癌細胞。作者之前的研究證明了骨細胞之間的樹突狀網絡，其中線粒體共享以維持骨微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。然后，作者向小鼠引入骨細胞特異性光激活線粒體（DMP1-PhAM），以研究骨細胞是否將線粒體轉移到轉移性癌細胞。用pLenti-CMV-mCherry-puro慢病毒感染LLC細胞，構建穩(wěn)定表達mcherry的LLC細胞（LLC- mcherry）。將LLC-mCherry細胞接種于DMP1-PhAM小鼠脛骨或髂動脈，建立骨轉移模型。14 d后處死荷瘤小鼠，分離腫瘤進行分析（圖2A）。共聚焦成像顯示，來自骨細胞的Dendra2+線粒體在兩種骨轉移模型的LLC-mCherry癌細胞中均存在（圖2B），表明線粒體從骨細胞轉移到轉移癌細胞的細胞間轉移。在骨髓中未觀察到骨細胞來源的線粒體（圖2B）。流式細胞術分析一致顯示，腫瘤中存在雙陽性細胞（mCherry +和Dendra2 +）（圖2E）。此外，作者根據(jù)scRNA-seq分析，分選和鑒定了腫瘤中接受骨細胞來源線粒體的細胞（圖2C）。利用已知的細胞類型特異性基因標志物，作者使用T-SNE方法顯示了5個簇，包括LLC-mCherry、巨噬細胞、單核細胞、T/NK細胞和成纖維細胞。所有表達mCherry序列的簇均被歸類為腫瘤細胞，這些腫瘤細胞占骨細胞來源的線粒體接受細胞的78.52%（圖2D）。

         近年來，人們描述了幾種細胞間線粒體轉移的途徑，包括隧道納米管（TNTs）、縫隙連接和微囊泡。為避免供體細胞的染料滲漏，作者用噬菌體感染骨細胞系MLO-Y4。MLO-Y4-mtDendra2慢病毒，穩(wěn)定生產線粒體特異性dendra2標簽蛋白（MLO-Y4-mtDendra2）。共聚焦成像顯示了MLO-Y4衍生的Dendra2+線粒體在連接癌細胞和骨細胞的納米管中的共定位（圖2F）。共培養(yǎng)24 h后，作者在LLC-mCherry細胞的細胞質中觀察到表達dendra2的線粒體（圖2G）。共聚焦切片和正交視圖也證實了LLC-mCherry細胞中存在表達dendra2的線粒體（圖2H）。此外，流式細胞術分析顯示，LLC-mCherry與MLO-Y4-mtDendra2共培養(yǎng)24 h后，出現(xiàn)新的雙陽性癌細胞（圖2I）。此外，作者觀察到MLO-Y4細胞中表達dendra2的線粒體向LLC-mCherry細胞動態(tài)遷移（圖2J）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明在骨轉移微環(huán)境中，骨細胞通過TNT將線粒體轉移到癌細胞。

圖2 骨轉移時骨細胞將線粒體轉移到癌細胞

3. Miro1和MFN2調控線粒體從骨細胞轉移到癌細胞

         據(jù)報道，線粒體Rho GTP酶1（Miro1）是TNT介導的細胞間線粒體轉移的關鍵調節(jié)因子。此外，作者之前的研究表明，MFN2參與了骨細胞樹突過程中線粒體的動態(tài)運動。為了確認MFN2和Miro1在骨細胞和癌細胞之間的細胞間線粒體轉移中的作用，作者用或特異性的短發(fā)卡RNA（shRNA）轉染MLO-Y4-mtDendra2細胞。作者觀察到，沉默或在MLO-Y4-mtDendra2細胞中降低了向LLC-mCherry細胞的細胞間線粒體轉移水平，這是在共培養(yǎng)24小時后通過流式細胞術測定的（圖3A，B）。在MLO-Y4-mtDendra2細胞過表達或在MLO-Y4-mtDendra2細胞中觀察到線粒體轉移顯著增加（圖3C，D）。

         為了研究MFN2或Miro1在體內對骨細胞和癌細胞之間線粒體轉移的影響，作者在DMP1-PhAM小鼠的背景下構建了兩種骨細胞條條性缺失或在骨細胞中的小鼠模型。作者向8周齡的DMP1-PhAM、DMP1-PhAM和DMP1-PhAM對照小鼠腹腔內注射LLC-mCherry。14 d后處死小鼠，切除腫瘤進行進一步分析。共聚焦成像顯示，在條條性去除或后，從骨細胞轉移到mcherry標記的LLC癌細胞的dendra2標記的線粒體顯著減少（圖3E，F）。與這些結果一致，流式細胞術分析顯示，在條條性去除或在骨細胞中，雙陽性癌細胞顯著減少（圖3G，H）。這些發(fā)現(xiàn)表明MFN2和Miro1參與介導骨細胞和癌細胞之間的線粒體轉移。

圖3 Miro1和MFN2調控線粒體從骨細胞轉移到癌細胞

4. 骨細胞線粒體抑制骨轉移癌進展

         為了研究骨細胞線粒體對體內癌細胞轉移的影響，作者將LLC癌細胞注射到8周齡的Dmp1Cre Mfn2?/?、Dmp1Cre Rhot1?/?小鼠和同周齡的野生型對照小鼠體內。如圖4A所示，與對照組相比，抑制來自骨細胞的線粒體轉移促進了骨轉移癌的進展（腫瘤重量、體積，圖4b）。與野生型對照相比，腫瘤相關脛骨的Micro-CT分析證實了溶骨性病變的存在，并表明在線粒體轉移受到抑制后，骨小梁體積和骨小梁數(shù)量減少（圖4C，D）。然后，作者用CMV-mCherry-Luc-殺稻菌素慢病毒感染LLC細胞，以建立穩(wěn)定表達熒光素酶的LLC細胞。將LLC-mCherry-Luc細胞注入10周齡Dmp1Cre Mfn2?/?、Dmp1Cre Rhot1?/?小鼠和同周齡野生型對照小鼠的髂動脈，建立另一種骨轉移模型。作者在脛骨內模型中發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢，即與對照野生型小鼠相比，小鼠和小鼠的骨轉移進展增加（圖4E，F）。

         此外，正如免疫印跡所示，MFN2在皮質骨蛋白中的水平隨著年齡的增長而下降（圖4G）。作者還觀察到，與年輕（1月齡）小鼠相比，在老年（18月齡）小鼠的皮質骨中，線粒體運輸相關基因的表達降低（圖4H）。然后，作者將LLC-mCherry植入年輕（2個月）、成熟（6個月）和老年（18個月）DMP1-PhAM小鼠的脛骨內。轉移性腫瘤的共聚焦成像顯示，DMP1-PhAM小鼠中，隨著年齡的增長，細胞間線粒體從骨細胞轉移到癌細胞的數(shù)量持續(xù)下降（圖4I，J）。此外，作者發(fā)現(xiàn)，與成熟和年輕小鼠相比，老年小鼠的脛骨內腫瘤進展增加（腫瘤重量、體積）。作者的數(shù)據(jù)顯示，骨細胞線粒體轉移到癌細胞抑制骨微環(huán)境中的骨轉移癌癥進展。隨著年齡的增長，細胞間線粒體轉移水平降低，這可能在骨微環(huán)境中參與了骨轉移癌的進展。

圖4 骨細胞線粒體抑制骨轉移癌進展

5. 骨細胞線粒體通過cGAS增加癌細胞胞質mtDNA并激活STING通路

         線粒體DNA（mtDNA）是一種有效的損傷相關分子模式（DAMP），已被報道可激活cGAS/STING固有免疫通路。為了測試外源性線粒體是否轉移到受體細胞，并激活cGAS/STING通路，作者應用MitoCeption人工和定量轉移線粒體到癌細胞。

         作者將骨細胞線粒體移植到LLC細胞中，24小時后進行亞細胞分離。通過定量聚合酶鏈反應檢測細胞內和細胞核中含有線粒體特異性基因和細胞核特異性基因的DNA相對水平。作者發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，線粒體移植組線粒體的細胞質mtDNA顯著增加（圖5A）。共聚焦成像還顯示，在接受骨細胞線粒體的細胞中，線粒體外細胞質中的雙鏈DNA信號更顯著（圖5B）。骨細胞線粒體移植到LLC細胞中導致了cGAS/STING的激活，如pSTING、pTBK1、pIRF3和下游核因子κB（NF-κB）pP65水平顯著升高所示（圖5C）。與此同時，通過MitoCeption進行線粒體轉移后，sting依賴性促炎基因的表達顯著上調（圖5D）。癌細胞中觀察到的STING通路的激活被敲低(KD)消除（圖5C，D）。此外，作者從小鼠、小鼠和野生型對照小鼠的髂內動脈模型中分離出癌細胞，并在野生型小鼠中檢測到類似的STING依賴性促炎基因表達顯著上調的趨勢（圖5E）。這些結果表明，骨細胞線粒體可以在癌細胞中激活cGAS/STING通路。

         根據(jù)以往的報道，BAX在調控線粒體釋放mtDNA中起著關鍵作用。因此，作者從KD MLO-Y4細胞中分離線粒體，并將其轉移到LLC癌細胞中。作者發(fā)現(xiàn)來自KD MLO-Y4細胞的線粒體不能增加細胞質mtDNA癌細胞的水平（圖5F）。此外，作者發(fā)現(xiàn)，在接受來自KD MLO-Y4細胞線粒體的LLC細胞的線粒體部分中，mtDNA水平顯著增加（圖5G）。這些結果表明，mtDNA從骨細胞線粒體釋放到癌細胞胞漿是依賴于BAX的。

圖5 骨細胞線粒體增加癌細胞胞質mtDNA，并通過cGAS激活STING

6. 骨細胞線粒體可提高腫瘤免疫原性，誘導抗腫瘤免疫

         最近的研究報道，癌細胞中cGAS/STING的激活導致二核苷酸cGAMP的產生，觸發(fā)樹突狀細胞和巨噬細胞中STING通路的激活，進而誘導CD8+ T和NK保護性抗腫瘤免疫。接下來，作者試圖探索抑制細胞間線粒體轉移后免疫微環(huán)境的變化。為了全面了解免疫微環(huán)境成分的變化，作者分離了荷瘤Dmp1Cre Mfn2?/?、Dmp1Cre Rhot1?/?小鼠和野生型對照的腫瘤，然后進行了scRNA-seq。在分選出CD45+的免疫細胞后，作者使用T - sne方法，根據(jù)已知的細胞標志物，識別并可視化了8個主要簇：T細胞、B細胞、NK細胞、中性粒細胞、DCs、單核細胞、巨噬細胞和細胞（圖6A，B）。作者觀察到T細胞比例增加。在Dmp1Cre Mfn2?/?和Dmp1Cre Rhot1?/?小鼠中，作者一致地檢測到腫瘤浸潤免疫細胞顯著減少（圖6C，E-G）。接下來，作者進行了基于9-plex珠鏈的檢測，以定量骨轉移微環(huán)境中的炎癥介質水平。體內細胞間線粒體轉移受到抑制后，幾種關鍵的炎癥細胞因子（包括白細胞介素-1α（IL-1α）、IL-1β和IL-18）、生長因子和趨化因子減少（圖6I），表明骨轉移微環(huán)境中的免疫激活較弱。根據(jù)經典標志物，作者將髓系細胞重新聚集成12個亞組，包括大多數(shù)被鑒定為單核細胞/巨噬細胞（80%~90%）的細胞和少數(shù)（<20%）被鑒定為DCs（圖6J）。與野生型對照組相比，Dmp1Cre Mfn2?/?、Dmp1Cre Rhot1?/?組的DC亞組，包括常規(guī)1型DCs (cDC1)，常規(guī)2型DCs（cDC2），遷移DCs（mDCs）和漿細胞樣DCs（pDCs）的總比例均下降（圖6K和L）。通過流式細胞術分析，作者觀察到腫瘤浸潤DCs的總比例下降（圖6D和H）。DCs是一組在腫瘤微環(huán)境中刺激淋巴細胞啟動抗腫瘤反應的特異性抗原提呈細胞。為了進一步監(jiān)測這些腫瘤浸潤DCs的活化狀態(tài)，作者發(fā)現(xiàn)在Dmp1Cre Mfn2?/?、Dmp1Cre Rhot1?/?組中，一系列DC成熟標志物在cDC1s中均下調（圖6M）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，抑制細胞間線粒體從骨細胞轉移到癌細胞促進骨轉移癌的進展和減少免疫浸潤，使“熱”腫瘤變成“冷”腫瘤。

圖6 骨細胞線粒體可提高腫瘤免疫原性，誘導抗腫瘤免疫

結論：

         該研究提供了一個可能的視角來理解年齡誘導的骨微環(huán)境的變化如何影響癌細胞的生物學行為和癌癥患者的進一步臨床結局。未來的工作將需要研究是否調節(jié)骨細胞線粒體可能代表骨轉移治療的治療靶點。

實驗方法：

         細胞培養(yǎng)，小鼠實驗，骨細胞消融，腫瘤移植，生物熒光成像，細胞轉染，線粒體分離和人工轉移，線粒體DNA分離和轉染，海馬耗氧量，亞細胞分離，DNA提取和mtDNA拷貝數(shù)分析，流式細胞術和FACS，單細胞RNA測序，原始數(shù)據(jù)處理、質量控制和下游分析，蛋白質印跡分析，組織病理學，包埋染色，免疫熒光，細胞成像與分析，Micro-CT analysis，RNA提取和實時PCR

參考文獻：

         Zhou H, Zhang W, Li H, Xu F, Yinwang E, Xue Y, et al. Osteocyte mitochondria inhibit tumor development via STING-dependent antitumor immunity. Sci Adv. 2024 Jan 19;10(3):eadi4298. doi: 10.1126/sciadv.adi4298.