“線粒體學(xué)—自噬”強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)手打造高分文章
腎小管上皮細(xì)胞（RTECs）是最富線粒體的細(xì)胞類型之一，因而容易發(fā)生線粒體失調(diào)事件，這也被認(rèn)為是糖尿病腎?。?/span>DN）中腎小管損傷的關(guān)鍵事件。然而，其潛在機(jī)制仍在很大程度上未知。在此，我們研究了腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8-like 1 （TNFAIP8L1/TIPE1）在高糖（HG）誘導(dǎo)的RTECs和DN進(jìn)展中的線粒體功能障礙中的作用和機(jī)制。本研究于2022年4月發(fā)表在《Redox Biology》IF:11.799期刊上。
技術(shù)路線：
主要實驗結(jié)果：
1、TIPE1在DN患者和小鼠的RTECs中顯著上調(diào)
為了初步評估TIPE1在DN中的潛在作用，作者首先分析了TIPE1在Nephroseq數(shù)據(jù)庫DN患者中表達(dá)，結(jié)果顯示，相比于健康組，TIPE1在DN組的表達(dá)顯著升高(Fig. 1A)，免疫組化進(jìn)一步確認(rèn)了該結(jié)果(Fig. 1B)。免疫熒光染色顯示TIPE1表達(dá)主要在DN患者和小鼠的腎小管上皮細(xì)胞中觀察到(Fig. 1C- D)。Western blot和RT-qPCR分析進(jìn)一步驗證了TIPE1在DN小鼠腎組織中的表達(dá)上調(diào)，這與腎小管損傷標(biāo)志物KIM1的水平升高相吻合(Fig. 1E–G)。與此一致，在HK-2細(xì)胞中，不同濃度(20 mM、40 mM)葡萄糖和不同時間點(diǎn)(24 h、48 h)誘導(dǎo)后TIPE1表達(dá)上調(diào)，同時KIM1、N-cadherin、α-SMA表達(dá)上調(diào)(Fig. 1H–J)。這些結(jié)果說明TIPE1在DN患者和小鼠的RTECs中顯著上調(diào)并可能參與DN的發(fā)病機(jī)制。
圖1 TIPE1在DN患者和小鼠的RTECs中顯著上調(diào)。
為了進(jìn)一步評估TIPE1在DN進(jìn)展中腎小管上皮細(xì)胞中的功能，作者構(gòu)建了腎小管上皮細(xì)胞特異性敲除TIPE1的小鼠（T1KO）（Fig. 2A-B）。Tipe1缺失降低了尿蛋白的含量（Fig. 2C）并顯著減輕了STZ誘導(dǎo)的腎小管損傷（Fig. 2D）和腎小管損傷標(biāo)志蛋白的表達(dá)，如KIM1和NGAL（Fig. 2E-G）。腎小管間質(zhì)中細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白的過度沉積是DN進(jìn)展的關(guān)鍵事件。因此，進(jìn)一步評估腎小管細(xì)胞間質(zhì)纖維化和EMT的程度。Tipe1缺失導(dǎo)致膠原積累減少，以Sirius染色和α-SMA的表達(dá)表征（Fig. 2H-I）。一致的，STZ處理后Tipe1缺失小鼠間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin、N-cadherin和TFs表達(dá)顯著下調(diào)，E-cadherin表達(dá)升高（Fig. 2J-L）。這些結(jié)果表明RTECs中Tipe1缺失可減輕糖尿病腎損傷和纖維化。
圖2 RTECs中缺乏Tipe1可減輕糖尿病腎損傷和纖維化。
作者使用人腎小管上皮細(xì)胞HK-2進(jìn)一步驗證了TIPE1在HG誘導(dǎo)腎小管損傷中的作用。與體內(nèi)實驗結(jié)果一樣，在HG誘導(dǎo)下，相比于Lv-NC，慢病毒攜帶Tipe1 shRNA （Lv-shTipe1）顯著降低了HK-2細(xì)胞中KIM1的表達(dá)(Fig. 3A and B)。一致地，在HK-2細(xì)胞中，沉默Tipe1也下調(diào)了間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物和TFs的表達(dá)，但上調(diào)了上皮標(biāo)志物的表達(dá)，尤其是在HG條件下(Fig. 3C–E)?？傊@些結(jié)果強(qiáng)烈支持TIPE1表達(dá)促進(jìn)腎小管細(xì)胞損傷、EMT和腎纖維化，從而加速DN進(jìn)展的觀點(diǎn)。
圖3 敲除TIPE1可改善HG環(huán)境下HK-2細(xì)胞損傷和EMT
3、在HG環(huán)境下Tipe1缺乏可改善線粒體穩(wěn)態(tài)并減少RTECs的凋亡
為了探究TIPE1調(diào)控HG誘導(dǎo)損傷和EMT進(jìn)程的分子機(jī)制，對野生型和TIKO突變型的STZ誘導(dǎo)的DN鼠的腎皮質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，總計篩選到1166個差異表達(dá)基因（DEGs）。對這些DEGs進(jìn)行GSEA分析，與WT小鼠相比，T1KO小鼠的腎皮質(zhì)組織中與三羧酸(TCA)循環(huán)相關(guān)的基因正富集(Fig. 4A)。一致地，T1KO小鼠腎組織中的ATP水平高于WT小鼠(Fig. 4B)。透射電鏡顯示，STZ誘導(dǎo)T1KO小鼠RTECs線粒體損傷率（表現(xiàn)為線粒體腫脹，內(nèi)外膜斷裂，線粒體嵴斷裂）明顯降低(Fig. 4C)。此外，DHE染色顯示T1KO小鼠腎組織中ROS水平降低(圖4D)。與體內(nèi)數(shù)據(jù)一致，氧消耗率(OCR)分析表明，在HK-2細(xì)胞中沉默Tipe1提高了氧化磷酸化能力和ATP生成(圖4E)。此外，MitoTracker Red和MitoSOX染色顯示，在HG處理的HK-2細(xì)胞中，下調(diào)Tipe1可上調(diào)線粒體膜電位，下調(diào)線粒體ROS水平(Fig. 4F and G)。與線粒體控制細(xì)胞活力的決定作用一致，RTECs中Tipe1缺失顯著降低了腎組織中TUNEL陽性細(xì)胞核的比例(Fig. 4H)。在HG條件下，Lv-shTIPE1感染的HK-2細(xì)胞凋亡也減少(Fig. 4I)。綜上所述，這些結(jié)果表明TIPE1具有調(diào)節(jié)管狀細(xì)胞線粒體穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞活力的能力，進(jìn)而決定DN的進(jìn)展。
圖4在HG環(huán)境下，Tipe1缺乏可改善線粒體穩(wěn)態(tài)并減少RTECs的凋亡
4、通過Tipe1消融增強(qiáng)線粒體自噬，可減輕高糖誘導(dǎo)的RTECs損傷和EMT
接下來，探究TIPE1如何控制RTECs的線粒體穩(wěn)態(tài)。線粒體自噬是清除損傷線粒體維持線粒體穩(wěn)態(tài)的過程。KEGG結(jié)果顯示相比于WT小鼠，線粒體自噬相關(guān)基因顯著富集于TIPE1敲除鼠的腎組織（Fig. 5A），這些基因與線粒體自噬誘導(dǎo)有關(guān)，例如Pink1，Parkin，Atg12，Mfn1/2上調(diào)，Sqstm1/p62，Rps27a基因下調(diào)（Fig. 5B）。Western blot分析證實，與WT小鼠相比，T1KO小鼠腎組織線粒體中PINK1、Parkin和LC3II蛋白水平上調(diào)，p62表達(dá)降低(Fig. 5C-D)。TEM也顯示T1KO小鼠腎組織中線粒體自噬小體數(shù)量明顯高于WT小鼠(Fig. 5E)。與WT小鼠相比，T1KO小鼠的腎組織中LC3與線粒體自噬的標(biāo)志基因COX-IV的共定位更為顯著(Fig. 5F and G)。HG條件下Lv-shTIPE1感染的HK-2細(xì)胞也有類似的結(jié)果(Fig. 5H and I)。這些結(jié)果表明，TIPE1在RTECs中是一種潛在的線粒體自噬抑制劑。
積累的數(shù)據(jù)表明，線粒體自噬是有缺陷線粒體選擇性降解的重要機(jī)制，參與腎損傷和修復(fù)。為了進(jìn)一步驗證線粒體自噬失調(diào)在TIPE1促進(jìn)小管細(xì)胞損傷中的重要性，我們用線粒體自噬抑制劑Mdivi-1對HK-2細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。觀察到，在Lv-shTIPE1感染的HK-2細(xì)胞中，PINK1表達(dá)的上調(diào)幾乎被消除。更重要的是，Mdivi-1可以減輕HK-2細(xì)胞中因TIPE1敲除引起的KIM1下調(diào)表達(dá)(Fig. 5J and K)。一致地，Mdivi-1處理顯著挽救了HK-2細(xì)胞中TIPE1沉默引起的EMT增強(qiáng)促進(jìn)作用，在Mdivi-1處理的對照細(xì)胞或TIPE1敲除的HK-2細(xì)胞中顯示相似水平的EMT標(biāo)記物(α-SMA、波形蛋白、N-cadherin和E-cadherin) (Fig. 5L-M)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，消融Tipe1增強(qiáng)了RTECs中的線粒體自噬，從而減緩了小管細(xì)胞損傷和EMT。
圖5通過Tipe1消融增強(qiáng)線粒體自噬，可減輕高糖誘導(dǎo)的RTECs損傷和EMT
5、TIPE1與PHB2相互作用并促進(jìn)PHB2的蛋白酶體降解
接下來，研究了TIPE1調(diào)控RTECs線粒體自噬的機(jī)制。越來越多的證據(jù)表明，TIPE1與多種蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)。因此，使用pcTIPE1-HA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的免疫沉淀進(jìn)行LC-MS/MS (Fig. 6A)。有30個潛在相互作用蛋白的蛋白質(zhì)得分大于200，其中（Fig. 6B），有報道稱，prohibitin 2 (PHB2)是一種線粒體膜內(nèi)蛋白，在哺乳動物細(xì)胞和線蟲中都發(fā)揮著重要的線粒體吞噬受體的作用。共免疫沉淀試驗表明，在pcTIPE1-HA轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中，TIPE1和PHB2相互作用（Fig. 6C）。內(nèi)源性關(guān)聯(lián)在對照組或HG處理的HK-2細(xì)胞中得到進(jìn)一步驗證（Fig. 6D）。HG條件下，Lv-shTIPE1感染HK-2細(xì)胞后，PHB2蛋白主要在線粒體中上調(diào)，而PHB2 mRNA與lv - NC感染細(xì)胞相當(dāng)（Fig. 6E–G）。環(huán)己酰亞胺（CHX）追蹤實驗進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，敲除TIPE1可增加HK-2細(xì)胞中PHB2蛋白的半衰期（Fig. 6H and I）。此外，用蛋白酶體抑制劑(MG132)而不是自噬抑制劑氯喹(CQ)處理可以消除TIPE1沉默引起的HK-2細(xì)胞中PHB2的上調(diào)（Fig. 6J and K），明TIPE1促進(jìn)PHB2的蛋白酶體降解。一致地，TIPE1的異位表達(dá)導(dǎo)致HEK293細(xì)胞中PHB2泛素化的增加（Fig. 6L）。這些結(jié)果表明，TIPE1與PHB2相互作用，并通過泛素-蛋白酶體途徑加速PHB2的降解。
圖6 TIPE1與PHB2相互作用并促進(jìn)PHB2的蛋白酶體降解
6、敲低PHB2消除Tipe1缺失對RTECs線粒體自噬、損傷和EMT的改善作用
為了驗證TIPE1在RTECs細(xì)胞線粒體吞噬和損傷中的調(diào)控作用，給WT或T1KO小鼠注射編碼PHB2 shRNA的慢病毒(Lv-shPHB2)或陰性對照慢病毒(Lv-NC)。發(fā)現(xiàn)敲除PHB2幾乎可以消除Tipe1缺失對RTECs線粒體自噬的作用，表現(xiàn)為Parkin、PINK1、LC3II/I和PHB2水平在WT和T1KO小鼠中相當(dāng)（Fig. 7A and B）。PHB2的沉默也消除了NGAL、EMT標(biāo)志物的表達(dá)差異（Fig. 7C-F）。HE和免疫組化染色進(jìn)一步證實，敲除PHB2幾乎消除了腎小管細(xì)胞Tipe1缺乏對腎損傷和纖維化的改善作用（Fig. 7G）?？傊@些結(jié)果支持管狀細(xì)胞TIPE1通過失調(diào)PHB2的表達(dá)抑制線粒體自噬并促進(jìn)DN進(jìn)展的觀點(diǎn)。
圖7敲低PHB2消除Tipe1缺失對RTECs線粒體自噬、損傷和EMT的改善作用
7、TIPE1在RTECs中的表達(dá)與DN患者的腎功能、線粒體吞噬和纖維化相關(guān)
為了探討TIPE1在人類DN中的臨床意義，進(jìn)一步分析了TIPE1表達(dá)與腎功能的相關(guān)性。自Nephroseq數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)顯示，TIPE1表達(dá)與DN患者的腎小球濾過率(GFR)呈負(fù)相關(guān)（Fig. 8A）。然后在DN患者的腎活檢中檢測TIPE1、PHB2和α-SMA的表達(dá)（Fig. 8B）。統(tǒng)計分析顯示，在DN患者中TIPE1表達(dá)與UACR呈負(fù)相關(guān)（Fig. 8C）。此外，TIPE1水平與α-SMA表達(dá)呈正相關(guān)，與PHB2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（Fig. 8D and E）。些結(jié)果進(jìn)一步支持了TIPE1在DN進(jìn)展中起促進(jìn)作用的觀點(diǎn)。
圖8 TIPE1在RTECs中的表達(dá)與DN患者的腎功能、線粒體吞噬和纖維化相關(guān)
總之，本研究確定了TIPE1在RTECs中調(diào)控DN進(jìn)展的關(guān)鍵作用。在HG條件下，TIPE1破壞PINK1/ parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，并破壞RTECs的線粒體穩(wěn)態(tài)。TIPE1上調(diào)是RTEC損傷和EMT的催化劑，最終促進(jìn)DN的發(fā)展。
圖9 TIPE1在RTECs中的上調(diào)通過干擾PHB2介導(dǎo)的線粒體自噬而加重DN的進(jìn)展。HG環(huán)境下RTECs中TIPE1的上調(diào)與PHB2相互作用并觸發(fā)其蛋白酶體降解，進(jìn)而破壞線粒體自噬和線粒體穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)DN的進(jìn)展。
參考文獻(xiàn)：
Liu Lei., Bai Fang., Song Hui., Xiao Rong., Wang Yuzhen., Yang Huimin., Ren Xiaolei., Li Shuangjie., Gao Lifen., Ma Chunhong., Yang Xiangdong., Liang Xiaohong.(2022). Upregulation of TIPE1 in tubular epithelial cell aggravates diabetic nephropathy by disrupting PHB2 mediated mitophagy. Redox Biol, 50(undefined), 102260. doi:10.1016/j.redox.2022.102260