lncRNA穩(wěn)定表達(dá)后與蛋白結(jié)合促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展

LncRNA在不同癌癥類型中異常調(diào)節(jié)被認(rèn)為是人類癌癥發(fā)生和進(jìn)展的重要調(diào)控元素。但是其在胃癌（GC）中的作用仍有較大空白。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA THAP7-AS1被SP1轉(zhuǎn)錄激活然后被METTL3介導(dǎo)的m6A修飾穩(wěn)定，進(jìn)而提高CUL4B進(jìn)入核中，從而發(fā)揮了原癌特性。本文于2021年10月發(fā)表在《Cell Death and Differentiation》IF：15.828期刊上。

技術(shù)路線：

主要實驗結(jié)果：

1、THAP7-AS1在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌樣本中上調(diào)

對10例GC樣本和2例非腫瘤胃組織進(jìn)行芯片分析，獲得lncRNA的差異表達(dá)譜，包含989個上調(diào)lncRNA（圖1A）。只有2個lncRNA，LOC100133669和THAP7-AS1滿足以下條件：差異倍數(shù)大于5，P<0.05，在GC中顯著上調(diào)（圖1B）。但是在72個GC臨床樣本中，只有THAP7-AS1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（LNM）的組織中的表達(dá)顯著非LNM組織（圖1C-D）。因此被初步選為候選基因。隨后發(fā)現(xiàn)THAP7-AS1同時定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，并能穩(wěn)定表達(dá)（圖1E-J）。

圖1 THAP7-AS1在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌樣本中上調(diào)

2、在GC細(xì)胞中SP1激活THAP7-AS1的轉(zhuǎn)錄

對THAP7-AS1進(jìn)行啟動子分析，如圖2A-B，啟動子207區(qū)域活性顯著低于509區(qū)域，表明-509-207區(qū)域是THAP7-AS1完整轉(zhuǎn)錄活性所需要的。隨后預(yù)測了5個與THAP7-AS1結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)當(dāng)過表達(dá)SP1，KLF5，EGR1后THAP7-AS1啟動子509-0區(qū)域活性顯著升高，但是只有SP1可以促進(jìn)THAP7-AS1的表達(dá)（圖2C-E）。為了確定SP1上3個與THAP7-AS1結(jié)合的位點的實際作用，進(jìn)行了單位點突變實驗，結(jié)果顯示SP1-1，SP-1-2和SP-1-3突變質(zhì)粒的THAP7-AS1啟動子的活性顯著下降，且下降倍數(shù)不同，表明3個結(jié)合位點各自獨立作用（圖2F-G）。ChIP結(jié)果顯示，SP1可以和THAP7-AS1啟動子之間結(jié)合，并且兩者的表達(dá)呈正相關(guān)（圖2H-J）。以上表明SP1結(jié)合THAP7-AS1啟動子進(jìn)而激活其轉(zhuǎn)錄。

圖2（上部分）THAP7-AS1由SP1激活

3、METTL3介導(dǎo)m6A修飾通過IGF2BP1依賴的RNA穩(wěn)定性增強THAP7-AS1表達(dá)

m6A修飾被認(rèn)為是最普遍的內(nèi)部RNA修飾，涉及到RNA的降解，穩(wěn)定性和剪切。為了評估m(xù)6A修飾在THAP7-AS1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中的重要作用，對THAP7-AS1序列進(jìn)行了m6A修飾預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其包含7個潛在的修飾位點。MeRIP實驗結(jié)果顯示THAP7-AS1確實存在m6A修飾（圖2K-L）。此外，過表達(dá)或敲除METTL3，而不是METTL14，可以顯著性增加或減少THAP7-AS1的水平（圖2M-P）。并且和非LNM組織比較，METTL3的表達(dá)在LNM中顯著上調(diào)，其表達(dá)和THAP7-AS1表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（圖2Q-R）。RNA pull-down實驗表明THAP7-AS1可以和METTL3直接結(jié)合（圖2P-Q）。敲除IGFBP1，而不是IGFBP2-3，導(dǎo)致THAP7-AS1表達(dá)下降，并且敲除IGFBP1后THAP7-AS1的穩(wěn)定性下降，RIP也發(fā)現(xiàn)IGFBP1和THAP7-AS1的直接結(jié)合（圖2S-U）。此外，在METTL3沉默的GC細(xì)胞中，IGFBP1和THAP7-AS1的結(jié)合顯著下降。因此，以上表明METTL3介導(dǎo)的m6A修飾通過IGFBP1依賴的增強THAP7-AS1穩(wěn)定性提高其表達(dá)。

圖2（下部分）THAP7-AS1由METTL3介導(dǎo)的m6A修飾轉(zhuǎn)錄后穩(wěn)定

4、THAP7-AS1促進(jìn)GC細(xì)胞體內(nèi)外的生長，遷移和侵襲

如圖3所示，過表達(dá)THAP7-AS1顯著促進(jìn)GC細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲，沉默則相反。在體內(nèi)，過表達(dá)THAP7-AS1增加了腫瘤體積，和肺轉(zhuǎn)移。

圖3 THAP7-AS1促進(jìn)GC細(xì)胞體內(nèi)外的生長，遷移和侵襲

5、THAP7-AS1結(jié)合CUL4B的核定位信號區(qū)域，介導(dǎo)CUL4B進(jìn)入細(xì)胞核

近來研究表明lncRNA通過和蛋白質(zhì)相互作用發(fā)揮功能，作者推測THAP7-AS1也可能是通過這種方式介導(dǎo)GC惡性表型。RNA pull-down和MS實驗鑒定了與THAP7-AS1結(jié)合的蛋白，包括CUL4B和STAT3（圖4A）。但是只有CUL4B在GC細(xì)胞中特異性結(jié)合THAP7-AS1（圖4B-D）。隨后，作者構(gòu)建了一系列截斷突變體去探究它和CUL4B的結(jié)合區(qū)域，發(fā)現(xiàn)THAP7-AS1的1-442nt區(qū)域是和CUL4B結(jié)合所必須的（圖4E）。FISH證實了兩者的共定位（圖4F），但是作者發(fā)現(xiàn)THAP7-AS1并不能改變CUL4B的表達(dá)（圖5A,E），提示THAP7-AS1不參與CUL4B的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。有趣的是，慢病毒轉(zhuǎn)染THAP7-AS1后，細(xì)胞質(zhì)中CUL4B表達(dá)減少，細(xì)胞核中CUL4B表達(dá)增加（圖4G-H），表明THAP7-AS1促進(jìn)CUL4B蛋白進(jìn)入細(xì)胞核。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)THAP7-AS1提高了NLS和importin α1的結(jié)合能力（圖4I-K），并且THAP7-AS1直接結(jié)合CUL4B的NLS區(qū)域（圖4L-O）；THAP7-AS1也可以直接結(jié)合importin α1（圖4P-S）。表明THAP7-AS1與importin α1和CUL4B的NLS區(qū)域結(jié)合，從而促進(jìn)CUL4B和importin α1的結(jié)合。隨后的挽救實驗證實了THAP7-AS1的生物學(xué)功能是通過CUL4B的核易位（圖4T-U）?？傊陨媳砻鱐HAP7-AS1結(jié)合CUL4B的核定位信號區(qū)域，介導(dǎo)CUL4B進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而促進(jìn)了GC細(xì)胞的惡性表型。

圖4 THAP7-AS1結(jié)合CUL4B的核定位信號區(qū)域，介導(dǎo)CUL4B進(jìn)入細(xì)胞核

6、THAP7-AS1/CUL4B復(fù)合物可啟動miR-22-3p/miR-320抑制PI3K/AKT信號通路

為了鑒定參與THAP7-AS1/CUL4B復(fù)合物介導(dǎo)的生物學(xué)功能的潛在基因，對si-THAP7-AS1和對照HC細(xì)胞進(jìn)行了RNA測序。與對照相比，在THAP7-AS1/CUL4B干擾組總計獲得6502個上調(diào)基因，5794個下調(diào)基因。如圖5的WB和RT-qPCR結(jié)果所示，PI3K/AKT信號通路上的基因，包括PIK3CA，PIK3CD，AKT3，顯著響應(yīng)THAP7-AS1或CUL4B的干擾或過表達(dá)處理；白合成抑制劑環(huán)己亞胺(CHX)和蛋白酶體抑制劑MG132處理實驗結(jié)果表明，THAP7-AS1/CUL4B是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控上述PI3K/AKT信號通路上的基因表達(dá)，而不影響他們的穩(wěn)定性和降解。

圖5 THAP7-AS1/CUL4B復(fù)合物啟動PI3K/AKT信號通路

鑒于miRNAs常見的轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控因子，所以作者猜測miRNA可能參與CUL4B對PI3K/AKT信號通路上的基因表達(dá)的調(diào)控。如圖6所示，作者使用GSE數(shù)據(jù)和在線預(yù)測獲得了5個候選miRNAs，進(jìn)一步驗證后鎖定了miR-22-3p/miR-320a，隨后實驗證實AKT3是miR-22-3p的靶基因，而miR-320a 可同時靶向調(diào)節(jié)PIK3CA，PIK3CD，AKT3蛋白的表達(dá)，挽救實驗也再次證實了這個結(jié)果?？傊陨媳砻鱐HAP7-AS1/CUL4B復(fù)合物通過miR-22-3p/miR-320靶向抑制PI3K/AKT信號通路。

圖6 THAP7-AS1/CUL4B復(fù)合物可啟動miR-22-3p/miR-320a抑制的PI3K/AKT信號通路

7、THAP7-AS1/CUL4B復(fù)合物轉(zhuǎn)錄抑制miR-22-3p/miR-320a表達(dá)通過CUL4B催化H2AK119ub1和EZH2介導(dǎo)的H3K27me3

研究發(fā)現(xiàn)CUL4B通過單泛素化H2AK119調(diào)控腫瘤抑制子的表觀遺傳失活。EZH2是PRC2的催化亞基，對于形成穩(wěn)定的、酶活性強的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物至關(guān)重要。為了檢測miR-22-3p和miR320a的表達(dá)是否受到上述表觀遺傳修飾的調(diào)控，用5-AZ、TSA和Dznep處理GC細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)在TSA和Dznep組顯著上調(diào)（圖7A-B），表明其啟動子存在組蛋白甲基化和組蛋白乙酰化?？笴UL4B、EZH2、H2AK119ub1、H3K27me3、HDAC1和HADC2或?qū)φ誌gG的ChIP檢測顯示，CUL4B(圖7C, G)、EZH2(圖7D, H)、H3K27me3(圖7E, I)和H2AK119ub1(圖7F, J)，有效地免疫沉淀了miR-22-3p和miR-320a的啟動子區(qū)域，表明它兩可被CUL4B催化的單泛素化H2AK119和PRC2-介導(dǎo)的H3K27me3調(diào)控。

敲除CUL4B導(dǎo)致CUL4B，EZH2，H3K27me3，H2AK119ub1綁定到miR-22-3p和miR-320a啟動子顯著減少。這表明CUL4B調(diào)節(jié)miR-22-3p和miR320a的轉(zhuǎn)錄抑制是通過招募PRC2（圖7K-R）。THAP7-AS1過表達(dá)導(dǎo)致與miR-22-3p和miR-320a啟動子結(jié)合的CUL4B和EZH2顯著增加，表明THAP7-AS1參與了CUL4B介導(dǎo)的PRC2招募（圖7S-V）。CUL4B敲低逆轉(zhuǎn)了THAP7- AS1過表達(dá)引起的pri-miR-22-3p/pri-miR-320a的下降，反之亦然(圖7W, X)。綜上所述研究表明THAP7-AS1/CUL4B復(fù)合物通過CUL4B催化的H2AK119ub1和ezh2介導(dǎo)的H3K27me3在轉(zhuǎn)錄水平抑制miR-22-3p/miR-320a的表達(dá)。

圖7 THAP7-AS1-CUL4B復(fù)合物可通過CUL4B催化的H2AK119ub1和EZH2介導(dǎo)的H3K27me3轉(zhuǎn)錄抑制miR-22-3p/miR-320a的表達(dá)

8、THAP7-AS1可作為胃癌患者的預(yù)后和治療標(biāo)志物

如圖8所示，THAP7-AS1高表達(dá)患者的LNM危險性更高，總體生存率更差，敲除THAP7-AS1后腫瘤大小和腫瘤下降，Ki67陽性率下降。提示THAP7-AS1可作為胃癌患者的預(yù)后和治療標(biāo)志物。

圖8 THAP7-AS1可作為胃癌患者的預(yù)后和治療標(biāo)志物

綜上所述，lncRNA在人GC組織中產(chǎn)生了差異表達(dá)譜。THAP7-AS1是一種新的促進(jìn)GC進(jìn)展的lncRNA，由SP1轉(zhuǎn)錄激活，并由METTL3介導(dǎo)的m6A修飾轉(zhuǎn)錄后穩(wěn)定。此外，THAP7-AS1促進(jìn)了CUL4B與importin α1的結(jié)合，并增強了CUL4B蛋白進(jìn)入細(xì)胞核的能力。THAP7-AS1/CUL4B復(fù)合物通過CUL4B催化的H2AK119ub1和ezh2介導(dǎo)的H3K27me3轉(zhuǎn)錄抑制miR-22-3p和miR-320a，從而激活PI3K/ AKT信號通路（圖8H）。本研究結(jié)果突出了GC中l(wèi)ncRNA、miRNA和蛋白之間重要的功能相互作用，提示THAP7-AS1可能成為GC治療的一個有前景的分子靶點。

參考文獻(xiàn)：

Liu Hai-Ting., Zou Yong-Xin., Zhu Wen-Jie., Sen-Liu., Zhang Guo-Hao., Ma Ran-Ran., Guo Xiang-Yu., Gao Peng.(2021). LncRNA THAP7-AS1, transcriptionally activated by SP1 and post-transcriptionally stabilized by METTL3-mediated m6A modification, exerts oncogenic properties by improving CUL4B entry into the nucleus. Cell Death Differ, undefined (undefined), undefined. Doi: 10.1038/s41418-021-00879-9