microRNA-circRNA(lncRNA) 靶基因驗證實驗

    環(huán)狀RNA(circRNA)和長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類非編碼RNA,不翻譯蛋白。但在細胞中它們能夠調(diào)控其他基因的表達變化。近年的研究表明circRNA和lncRNA分子富含microRNA結合位點，在細胞中起到miRNA海綿（miRNA sponge）的作用，進而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達水平，這一作用機制被稱為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）機制。因此，通過與疾病關聯(lián)的miRNA相互作用，circRNA和lncRNA在疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。研究cirRNA、lncRNA的調(diào)控機制需要先找到與cirRNA、lncRNA相互作用的miRNA，而熒光素酶報告基因?qū)嶒灴梢杂脕碜C明miRNA與circRNA, miRNA與lncRNA的直接相互作用。


 
英拜生物microRNA報告基因?qū)嶒灹鞒蹋?br/>1.  microRNA靶點的預測
利用Targetscan,miRanda,PicTar軟件得到目的microRNA的預測靶點序列。
2.  獲得microRNA靶點序列
根據(jù)提供的靶序列，合成兩條互補的單鏈DNA模板?；蛘?，設計引物PCR擴增microRNA靶基因序列(lncRNA,circRNA全長序列或靶標序列)。
3.  cirRNA靶序列克隆
將合成的兩條單鏈退火成雙鏈（具有粘性末端），或?qū)CR產(chǎn)物雙酶切，后連入經(jīng)過同樣雙酶切的Psicheck-2載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。
4.  陽性克隆鑒定。
挑選轉(zhuǎn)化的菌落，PCR篩選含有插入片段的陽性克隆，測序驗證克隆的序列和目的microRNA靶序列一致。
5.  細胞轉(zhuǎn)染準備
將psicheck-2報告基因載體、microRNA　mimics或microRNA negative control共轉(zhuǎn)染293T或Hela細胞。
6.  熒光素酶檢測
報告基因載體與microRNA　mimics或microRNA negative control共轉(zhuǎn)染293T或Hela細胞24-72h后，進行雙熒光素酶檢測，確定目的microRNA的靶基因。
7.  整理分析數(shù)據(jù)，得出結論。
提供有microRNA靶序列的報告基因質(zhì)粒、甘油保存菌株各一支。附實驗報告，包括載體構建過程，鑒定記錄，測序報告，細胞轉(zhuǎn)染，熒光檢測。