原位雜交(in situ hybridization, ISH)是用標記的DNA或RNA為探針,根據(jù)堿基互補配對原則,在原位檢測組織細胞內特定核酸序列的方法。根據(jù)探針的標記物是否直接被檢測,原位雜交可分為直接法和間接法。直接法主要用放射性同位素、熒光及某些酶標記的探針與靶核酸進行雜交,通過放射自顯影、熒光顯微鏡術或成色酶促反應直接顯示。間接法用半抗原標記探針,通過免疫組織化學法對半抗原定位,間接顯示探針與靶核酸形成的雜交體。非放射性標記的原位雜交具有安全、經(jīng)濟、靈敏度高等優(yōu)點,因而生物素標記探針digaoxin標記探針迅速發(fā)展。
標記探針迅速發(fā)展。
1、原位雜交(digaoxin)實驗流程
蛋白酶K處理
預雜交
探針變性
雜交
洗滌
消化殘余的RNA
封閉液封閉30min。
抗體孵育1~2h。
洗滌
顯色BCIP/NBT顯色液加至標本上避光顯色20min。若無背景出現(xiàn)可繼續(xù)顯色過夜。
核固紅復染,充分自來水沖洗。
梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片,光鏡觀察拍照。
2、熒光原位雜交實驗流程(FISH)
1、脫蠟
2、蛋白酶處理
3、變性
4、雜交
5、雜交后水洗
6、檢測
7、擴增
8、DAPI封片,熒光顯微鏡拍照。