阿爾茨海默病組蛋白H4賴氨酸12乳酸化對小膠質(zhì)細(xì)胞糖代謝的正反饋調(diào)節(jié)

實驗方法：組蛋白提取，qChIP，海馬細(xì)胞外通量測定，莫里斯水迷宮，經(jīng)腦室(ICV)注射，硫黃素S (TS)染色，免疫熒光

  小膠質(zhì)細(xì)胞的促炎激活是阿爾茨海默病(AD)的一個標(biāo)志，這一過程涉及從氧化磷酸化(OXPHOS)向糖酵解的轉(zhuǎn)變。我們展示了小膠質(zhì)細(xì)胞中的正反饋循環(huán)如何驅(qū)動AD的發(fā)病機(jī)制，并且我們證明抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中的這一循環(huán)可以改善AD小鼠模型(5XFAD)中的Aβ負(fù)擔(dān)和認(rèn)知缺陷。首先在5XFAD小鼠和AD患者的腦樣本中檢測到組蛋白乳酸化升高后，我們觀察到H4K12la水平在Aβ斑塊附近的小膠質(zhì)細(xì)胞中升高。這種乳酸依賴性組蛋白修飾在糖酵解基因的啟動子上富集并激活轉(zhuǎn)錄，從而增加糖酵解活性。最終，糖酵解/H4K12la/PKM2正反饋回路加重了AD的小膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙。藥理抑制PKM2可減弱小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，而小膠質(zhì)細(xì)胞特異性消融PKM2可改善AD小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶。因此，破壞正反饋回路可能是治療AD的一種潛在的治療方法。本文于2022年4月發(fā)表于Cell Metabolism (IF=31.373)。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

(1) 遺傳性AD模型小鼠海馬乳酸水平升高

已知小膠質(zhì)細(xì)胞具有代謝靈活性。鑒于AD小膠質(zhì)細(xì)胞中從OXPHOS到糖酵解的代謝重編程，我們首先檢測了5XFAD小鼠海馬中的乳酸水平。5XFAD是一種成熟的AD轉(zhuǎn)基因模型。比色分析顯示，與年齡匹配的WT小鼠相比，12月齡5XFAD小鼠的乳酸水平顯著升高(圖1A)，這與先前報道的結(jié)果一致，即AD患者的腦脊液(CSF)乳酸濃度高于健康對照組。

圖1：5XFAD小鼠和AD患者組蛋白乳酸活性升高

(2) 5XFAD小鼠和AD患者組蛋白乳酸化升高

由于乳酸作為一種前體可以刺激組蛋白乳酸化，因此很容易假設(shè)組蛋白乳酸化可能在AD的背景下發(fā)生改變。酸提取組蛋白的WB分析顯示，與年齡匹配的WT小鼠相比，12月齡5XFAD小鼠的額葉皮層和海馬中的泛賴氨酸乳酸化(Pan Kla)和H4K12la水平均有所增加(圖1B)。通過對小鼠的觀察，AD患者死后腦組織中Pan Kla和H4K12la的水平較健康人明顯升高(圖1C)。這些結(jié)果支持在AD的情況下乳酸和組蛋白乳酸化都增加。

(3) H4K12la水平在5XFAD小鼠斑塊鄰近小膠質(zhì)細(xì)胞中特異性升高

為了檢測不同腦細(xì)胞類型中組蛋白乳酸化的變化，我們將H4K12la與針對神經(jīng)元(NeuN)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)和小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba1)標(biāo)記物的抗體進(jìn)行了免疫熒光共染色。大多數(shù)細(xì)胞顯示H4K12la熒光(圖1D-1F)；在5XFAD和WT小鼠之間，我們沒有觀察到神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞中H4K12la強(qiáng)度的明顯差異(圖1D和圖1E)。對離體神經(jīng)元和離體星形膠質(zhì)細(xì)胞中酸提取的組蛋白進(jìn)行WB檢測顯示，5XFAD小鼠和WT小鼠的H4K12la水平?jīng)]有差異(圖1D和1E)。然而，與遠(yuǎn)離斑塊的5XFAD小膠質(zhì)細(xì)胞和WT小膠質(zhì)細(xì)胞相比，Aβ斑塊鄰近小膠質(zhì)細(xì)胞的H4K12la信號強(qiáng)度顯著升高(圖1F)。我們從12個月大的5XFAD和WT小鼠的成年大腦中分離小膠質(zhì)細(xì)胞，然后用組蛋白酸提取和抗多種形式組蛋白乳酸化的抗體進(jìn)行WB分析，結(jié)果表明H4K12la是5XFAD小鼠斑塊鄰近小膠質(zhì)細(xì)胞中最普遍的差異影響組蛋白乳酸化修飾(圖1G)。

(4) 小膠質(zhì)細(xì)胞中H4K12la轉(zhuǎn)錄結(jié)果的全基因組分析

組蛋白修飾改變可以影響靶基因的轉(zhuǎn)錄激活和抑制。為了探索H4K12la在AD小膠質(zhì)細(xì)胞中的潛在功能意義，我們進(jìn)行了全基因組CUT&Tag分析，以確定小膠質(zhì)細(xì)胞中受H4K12la調(diào)控的候選基因。通過磁分離收集12月齡WT或5XFAD小鼠的總腦細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞(圖2A)：使用抗H4K12la抗體的CUT&Tag和deepTools分析顯示，與WT相比，5XFAD大腦的小膠質(zhì)細(xì)胞中H4K12la峰明顯富集(圖2B)。小膠質(zhì)細(xì)胞對比顯示14437個不同的H4K12la結(jié)合峰，其中41.33%的峰位于啟動子序列(%3Kb)內(nèi)。在所有細(xì)胞樣本中，5XFAD小鼠中只有670個差異H4K12la結(jié)合峰，其中26.12%位于啟動子序列(圖2C)。

為了研究H4K12la對5XFAD小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的表觀遺傳調(diào)控作用，我們將5XFAD小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞啟動子處不同H4K12la結(jié)合峰的4410個靶基因按基因本體劃分為不同的KEGG通路(圖2D)。這些KEGG通路包括參與糖酵解和炎癥的HIF-1、toll樣受體、NF-kB和tnf信號通路(圖2D)。這些峰在糖酵解基因(包括Hif-1a、Pkm和Ldha)上鑒定出候選基因組位點，表明這些基因啟動子處的H4K12la水平升高(圖2E)。

定量染色質(zhì)免疫沉淀(qChIP)分析表明，與WT小膠質(zhì)細(xì)胞相比，5XFAD小鼠分離的小膠質(zhì)細(xì)胞中Hif-1a、Pkm和Ldha啟動子上的H4K12la水平顯著升高(圖2F)。與此一致，qPCR顯示，這些基因在5XFAD小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著升高(圖2G)。鑒于我們發(fā)現(xiàn)AD小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞中H3K18la水平升高，我們使用qChIP(使用針對H3K18la的抗體)檢測了WT和5XFAD小鼠分離的小膠質(zhì)細(xì)胞?？傊?，H4K12la修飾激活了AD小膠質(zhì)細(xì)胞中編碼已知糖酵解酶的多個基因的轉(zhuǎn)錄。

我們在2、6和12個月大的5XFAD和WT小鼠分離的小膠質(zhì)細(xì)胞的時間過程數(shù)據(jù)集中檢測了組蛋白乳酸化水平。H4K12la水平在5XFAD小膠質(zhì)細(xì)胞中以年齡依賴的方式增加。與年齡匹配的WT小膠質(zhì)細(xì)胞相比，6月齡和12月齡的5XFAD小膠質(zhì)細(xì)胞中Pan Kla和H4K12la的水平均明顯升高(圖S2A)。隨著5XFAD小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中AD發(fā)病機(jī)制的進(jìn)展，Hif-1a、Pkm2和Ldha的表達(dá)也隨之顯著增加(圖S2B)?？紤]到組蛋白乳酸化依賴于糖酵解產(chǎn)生的底物的存在，并且考慮到我們發(fā)現(xiàn)H4K12la修飾促進(jìn)糖酵解基因的表達(dá)，似乎有可能在H4K12la和糖酵解之間存在正反饋回路，傳播我們在AD大腦小膠質(zhì)細(xì)胞中觀察到的代謝開關(guān)/重新連接(圖2H)。

圖2：小膠質(zhì)細(xì)胞中H4K12la轉(zhuǎn)錄結(jié)果的全基因組分析

(5) 糖酵解/H4K12la/PKM2在AD小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中形成正反饋回路

我們使用WB檢測分離成人小膠質(zhì)細(xì)胞中的PKM2水平，發(fā)現(xiàn)與年齡匹配的WT小鼠相比，6個月大的5XFAD小鼠中PKM2的小膠質(zhì)細(xì)胞積累顯著增加(圖3A)。與PKM2的代謝功能一致，我們還發(fā)現(xiàn)AD小膠質(zhì)細(xì)胞中的乳酸水平顯著升高(圖3B)，支持AD小膠質(zhì)細(xì)胞中有氧糖酵解的異常激活。

我們對小膠質(zhì)細(xì)胞(抗iba1)和Aβ斑塊區(qū)域(抗6e10)進(jìn)行了PKM2免疫熒光染色。與我們的WB結(jié)果一致，該染色顯示，與WT小鼠相比，AD小鼠腦切片中PKM2信號明顯增加(圖3C)。值得注意的是，PKM2的上調(diào)特異性地定位于Aβ斑塊鄰近的小膠質(zhì)細(xì)胞，這與我們之前在AD小膠質(zhì)細(xì)胞中檢測到的H4K12la水平升高一致。PKM2與神經(jīng)元標(biāo)記物(抗neun)或星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(抗gfap)共染色表明PKM2未與神經(jīng)元共定位(圖3D)，但在5XFAD和WT腦的星形膠質(zhì)細(xì)胞中均顯示明顯的PKM2信號(圖3E)；星形膠質(zhì)細(xì)胞中糖酵解的基礎(chǔ)水平較高，這一發(fā)現(xiàn)與之前的報道一致，即星形膠質(zhì)細(xì)胞可以向附近的神經(jīng)元供應(yīng)乳酸。這些結(jié)果支持了AD小膠質(zhì)細(xì)胞中存在一個由活性糖酵解、H4K12la和PKM2組成的正反饋循環(huán)的概念。

我們對死后人AD腦切片的PKM2和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(抗iba1)和Aβ斑塊(硫黃素S, TS)進(jìn)行了免疫熒光染色。與我們在5XFAD小鼠中觀察到的結(jié)果一致，與斑塊遠(yuǎn)端和健康個體的小膠質(zhì)細(xì)胞相比，PKM2在斑塊鄰近小膠質(zhì)細(xì)胞中特異性上調(diào)(圖3F)?？傊?，這些都支持糖酵解/H4K12la/PKM2正反饋回路可以“鎖定”AD小膠質(zhì)細(xì)胞的代謝重連接。

圖3：糖酵解/H4K12la/PKM2在小膠質(zhì)細(xì)胞中形成正反饋回路

(6) 抑制PKM2破壞小膠質(zhì)細(xì)胞中的糖酵解/H4K12la/PKM2正反饋回路

為了實驗證實糖酵解/H4K12la/PKM2環(huán)對小膠質(zhì)細(xì)胞的功能影響，我們在培養(yǎng)的小膠質(zhì)BV2細(xì)胞中構(gòu)建了PKM2穩(wěn)定敲除細(xì)胞系。Pkm2的敲低導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)乳酸水平以及Pan Kla和H4K12la水平的顯著降低(圖3G和3H)。重要的是，qChIP分析顯示，與對照細(xì)胞相比，Pkm2敲低的BV2細(xì)胞中糖酵解基因啟動子(包括hif-1a、Pkm和Ldha)上的H4K12la水平顯著降低(圖3I)。與之前h4k12la介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活一致，qPCR顯示，在Pkm2敲低的BV2細(xì)胞中，hif-1a、Pkm2和Ldha的表達(dá)水平顯著降低(圖3J)。

用已知的PKM2抑制劑(紫草素或化合物3K)治療BV2細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)乳酸水平以及Pan Kla和H4K12la水平顯著降低(圖3K和3L)。與Pkm2敲低細(xì)胞的結(jié)果一致，紫草素或復(fù)方3K處理顯著降低了hif-1a、Pkm和Ldha啟動子上的H4K12la水平(圖3M)，這些基因的表達(dá)也顯著降低(圖3N)。總之， PKM2抑制破壞了小膠質(zhì)細(xì)胞中的糖酵解/H4K12la/PKM2正反饋回路。

(7) 阻斷PKM2阻斷糖酵解/H4K12la/PKM2環(huán)可抑制5XFAD小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞活化

我們通過將Pkm2^f/f小鼠與CX₃CR₁^CreER小鼠雜交(在5XFAD背景下)，實現(xiàn)了小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中Pkm2的特異性缺失(圖4A)。為了消融小膠質(zhì)細(xì)胞中的Pkm2，2月齡小鼠連續(xù)5天灌胃他莫昔芬20 mg。隨后對5個月大的動物進(jìn)行行為測試和病理分析(圖4A)。PKM2水平在cKO、AD (Pkm2^f/f；CX₃CR₁^CreER；5XFAD)小膠質(zhì)細(xì)胞與f/f;AD (Pkm2^f/f；5XFAD)小膠質(zhì)細(xì)胞的比較(圖4B)。小膠質(zhì)細(xì)胞Pkm2敲除導(dǎo)致PKM1水平和ATP產(chǎn)生顯著增加(圖S3)。與此一致的是，海馬細(xì)胞外通量測定顯示，與WT小膠質(zhì)細(xì)胞相比，Pkm2敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞耗氧量(OCR)顯著升高(圖S3D)。這些結(jié)果表明，小膠質(zhì)細(xì)胞Pkm2敲除導(dǎo)致PKM1的代償性表達(dá)和糖酵解向OXPHOS的代謝轉(zhuǎn)變。我們還檢測到Pkm2敲除后的小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)乳酸水平、Pan Kla和H4K12la水平以及Hif-1a和Ldha的表達(dá)均顯著降低，無論是體外還是體內(nèi)(圖4C和S4A-S4E)。注意，在添加乳酸鹽后，這些下降又恢復(fù)了(圖S4A-S4E)。額外的免疫熒光分析證實，Pkm2缺乏降低了小膠質(zhì)細(xì)胞中H4K12la的水平，斑塊鄰近小膠質(zhì)細(xì)胞的降低尤為明顯(圖4D)。

AD是一種慢性神經(jīng)炎性疾病，伴有小膠質(zhì)細(xì)胞異常激活，逐漸導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙。我們用抗PKM2和抗Aβ(抗6E10)抗體對小膠質(zhì)細(xì)胞(抗iba1)進(jìn)行了共染色。AD腦切片中具有強(qiáng)PKM2信號的小膠質(zhì)細(xì)胞異常激活；這些表型在cKO;AD腦切片中不明顯(圖4E)。WB顯示，與f/f;AD提取物相比，cKO;AD海馬提取物中Iba1水平明顯降低，進(jìn)一步支持小膠質(zhì)細(xì)胞增生(圖4F)。

對小鼠腦切片進(jìn)行Iba1、Aβ(抗6E10)和TMEM119(一種小膠質(zhì)細(xì)胞特異性穩(wěn)態(tài)蛋白)的聯(lián)合染色。正如預(yù)期的那樣，Iba1⁺TMEM119^?表明，f/f;AD小鼠的Aβ斑塊鄰近小膠質(zhì)細(xì)胞偏離了穩(wěn)態(tài)階段小膠質(zhì)細(xì)胞(圖S5)。然而，Aβ斑塊周圍的小膠質(zhì)細(xì)胞在cKO;AD小鼠中部分重新表達(dá)了TMEM119(圖4G)。qPCR表明，與f/f;AD小膠質(zhì)細(xì)胞相比，從cKO;AD小鼠中分離出的小膠質(zhì)細(xì)胞顯著增加了小膠質(zhì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)基因如Tmem119, P2ry12和Tgfb1的表達(dá)，而促炎基因包括Tnf-a, iNos和Il-1b的表達(dá)顯著降低(圖4H)。這些發(fā)現(xiàn)表明，通過基因刪除PKM2來中斷糖酵解/H4K12la/PKM2環(huán)可抑制5XFAD小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞促炎激活。

圖4：PKM2基因缺失可改善5XFAD小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙和神經(jīng)炎癥

(8) PKM2特異性消融術(shù)可改善5XFAD小鼠的Aβ病理

小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥促進(jìn)了Aβ的產(chǎn)生并促進(jìn)了Aβ斑塊的形成。我們采用TS染色法檢測f/f;AD和cKO;AD小鼠腦切片中的Aβ斑塊，探討糖酵解/H4K12la/PKM2環(huán)的中斷是否會影響AD小鼠的Aβ病理。小膠質(zhì)細(xì)胞特異性消融Pkm2導(dǎo)致包括皮質(zhì)和海馬在內(nèi)的大腦區(qū)域Aβ斑塊含量顯著降低(圖5A和5B)。與我們的TS染色結(jié)果一致，WB顯示cKO;AD小鼠的皮質(zhì)和海馬中Aβ水平與f/f;AD小鼠相比顯著降低(圖5C)。此外，與f/f;AD小鼠相比，cKO;AD小鼠營養(yǎng)不良神經(jīng)突的總面積(lamp1陽性免疫染色信號)顯著減少(圖S6)，表明AD小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞Pkm2缺失具有神經(jīng)保護(hù)作用。這些結(jié)果表明，通過破壞PKM2功能來中斷糖酵解/H4K12la/PKM2環(huán)可以改善5XFAD小鼠的Aβ病理。

圖5：5XFAD小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中PKM2特異性消融可改善Aβ病理并改善空間學(xué)習(xí)和記憶

(9) PKM2特異性消融術(shù)可改善5XFAD小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶

Morris水迷宮實驗檢測空間學(xué)習(xí)記憶能力發(fā)現(xiàn)，與f/f;AD小鼠相比，cKO;AD小鼠的學(xué)習(xí)能力顯著提高(即在訓(xùn)練試驗中，cKO;AD小鼠對平臺的逃避潛伏期更短；圖5D)。cKO;AD小鼠在探針試驗期間首次進(jìn)入目標(biāo)(平臺)的潛伏期明顯縮短，進(jìn)入目標(biāo)的次數(shù)明顯增加，在目標(biāo)象限的時間明顯增加(圖5E-5H)，結(jié)果表明cKO;AD小鼠的記憶保持能力更好。值得注意的是，游泳速度在小鼠之間沒有明顯差異(圖5I)，這表明cKO;AD小鼠這些表型的減輕不是由于運動能力的改變?？偟膩碚f，通過阻斷PKM2來中斷糖酵解/H4K12la/PKM2環(huán)可以挽救5XFAD小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶缺陷。

(10) 藥理抑制PKM2可降低5XFAD小鼠的Aβ負(fù)荷和小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度

為了測試藥理學(xué)上抑制PKM2是否對AD有任何保護(hù)作用，我們每隔一天給4個月大的5XFAD小鼠腦室內(nèi)注射PKM2抑制劑(紫草素或化合物3K)，持續(xù)1個月，之后對大腦進(jìn)行AD相關(guān)病理分析。PKM2的化學(xué)抑制顯著降低了海馬和皮質(zhì)等腦區(qū)Aβ斑塊的含量(圖6A和6B)。此外，這兩種抑制劑也明顯降低PKM2水平，降低反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞的程度，并部分逆轉(zhuǎn)5XFAD小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的變形蟲形態(tài)(圖6C和6D)?；瘜W(xué)抑制PKM2也顯著抑制了低聚抗體刺激的原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-6和TNF-a等促炎因子的水平(圖6E)?？傊?，通過抑制PKM2功能來中斷小膠質(zhì)細(xì)胞中的糖酵解/H4K12la/PKM2環(huán)可以被理解為減輕AD神經(jīng)炎癥的潛在策略。

圖6：藥理抑制PKM2可減輕5XFAD小鼠的Aβ負(fù)荷和神經(jīng)炎癥程度

結(jié)論：糖酵解/H4K12la/PKM2正反饋回路加劇了AD的小膠質(zhì)細(xì)胞激活和功能障礙。通過阻斷PKM2阻斷該環(huán)可降低H4K12la水平，從而在轉(zhuǎn)錄上抑制一組糖酵解基因，從而降低乳酸水平。除了我們證明這種抑制可以改善小膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙之外，我們的研究還表明，抑制這種惡性反饋循環(huán)代表了治療AD的潛在治療策略。

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